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研究背景:2型糖尿病是因胰岛素分泌不足或其作用缺陷所致的以血糖升高为主要特征的一种常见的代谢性疾病。随着经济的发展及人口平均寿命的延长,糖尿病的发病率持续提高并有发病年轻化的趋势,严重影响全球人类的健康。近年来,我国糖尿病的患病人数增长速度令人震惊。目前的内分泌治疗主要包括饮食控制、药物干预、合理运动,但口服降糖药物难以维持稳定的血糖,注射胰岛素的依从性差,使得绝大多数糖尿病患者的血糖控制并不理想,最终难以避免发生各种糖尿病相关并发症的发生,比如失明、肾功能衰竭、脑卒中、糖尿病足等。糖尿病的病因复杂,机制不明,近期内科治疗难有突破性的进展。近年来,越来越多的证据显示,手术治疗糖尿病确有疗效,不仅能从根本上控制血糖,还能阻止糖尿病相关并发症的发生,被认为是一种新的安全、有效的治疗方法,给糖尿病患者带来了希望。在2011年,国际糖尿病联盟正式推荐外科手术为肥胖合并2型糖尿病的治疗方法。虽然手术治疗糖尿病疗效确切,但其治疗机制尚在不断研究中。目前的研究结果中,胰高血糖素样肽-1被认为是糖尿病患者在术后参与调节胰岛素控制血糖的主要胃肠道激素之一。在糖尿病患者中,胰高血糖素样肽-1存在表达下调;而在经过转流术后的糖尿病患者中,胰高血糖素样肽-1较对照组有明显的表达上调,提示胰高血糖素样肽-1可能是糖尿病患者在术后血糖得以控制的重要因素。胰高血糖素样肽-1由远端小肠的L细胞分泌,在体内可被广泛存在的二肽基肽酶-4快速灭活。而胰高血糖素样肽-1的类似物艾塞那肽,不仅模拟了胰高血糖素样肽-1的功能,还不会被二肽基肽酶-4灭活,是近年来用于临床的新型短效降糖药,具有有效控制血糖、保护β细胞、减轻体重、保护心血管、改善非酒精性脂肪肝病等疗效。研究目的:本实验拟通过研究胰高血糖素样肽-1类似物艾塞那肽(Exendin-4)抑制RIN-m5f胰岛素瘤细胞凋亡的可能机制,探讨胃肠转流手术治疗2型糖尿病的可能机制,为手术治疗糖尿病提供更多的理论依据。研究方法:1.通过预实验确定刺激大鼠胰岛素瘤RIN-m5f细胞的高糖浓度和刺激时间将RIN-m5细胞分为A、B、C三组,然后接种于96孔板,每组细胞设置5个复孔。A组使用含糖浓度为11.1mmol/L的完全培养基,B组交替使用含糖浓度为22.2mmol/L和11.1mmol/L的完全培养基,C组交替使用含糖浓度为33.3mmol/L和11.1mmol/L,每24h更换一次培养基。在相同条件下培养3、5、7天后进行MTT检测各组细胞增殖活力以确定实验高糖浓度及刺激时间。2.预实验确定艾塞那肽刺激浓度在高糖浓度相同的刺激条件下,将细胞分为三组,分别使用含有浓度为50nmmol/L、100nmmol/L、150nmmol/L艾塞那肽的完全培养基,在相同培养条件下培养7天后行通过MTT检测三组细胞的增殖活力以确定艾塞那肽使用浓度。3.通过MTT检测高糖刺激及艾塞那肽对细胞增殖活力的影响将大鼠RIN-m5f胰岛素瘤细胞分成对照组、高糖组、高糖+艾塞那肽组3组,每组5个复孔,接种于96孔板,分别用含有正常糖(11.1mmol/L)、间歇性高糖(11.1 mmol/L、33.3 mmol/L交替使用)、间歇性高糖+艾塞那肽(100nmol/L)的培养基进行细胞培养,连续培养7天后,通过MTT法检测各组细胞增殖活力。4.Western blotting方法检测细胞相关蛋白的表达相对量将RIN-m5f细胞分为对照组、高糖组、高糖+艾塞那肽组3组,分别用含有正常糖、间歇性高糖、间歇性高糖+艾塞那肽的培养基进行细胞培养,相同条件下连续培养7天后提取细胞蛋白并通过Western blotting方法检测各组细胞中内质网应激标志分子(CHOP、BIP)、磷酸化的c-jun氨基末端激酶(p-JNK)、凋亡分子Caspase-3的表达水平。5.流式细胞技术检测各组细胞凋亡情况将RIN-m5f细胞分为对照组、高糖组、高糖+艾塞那肽组3组,分别用含有正常糖、间歇性高糖、间歇性高糖+艾塞那肽的培养基进行细胞培养,相同条件下连续培养7天后,通过流式细胞技术检测各组细胞凋亡情况。实验结果:1.各组细胞增殖活力用光密度(Optical density,OD)值均数与标准差表示:对照组(0.9333±0.0451),高糖组(0.3567±0.0252),高糖+艾塞那肽组(0.5867±0.0153)。高糖组细胞活力较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);高糖及艾塞那肽组细胞活力较高糖组明显升高,差异有统计学意义(P=0.0002)。2.各组细胞中目的蛋白的相对表达水平用目的蛋白的积分光密度值(IOD值)/内参的IOD值来表示,对照组RIN-m5f细胞中CHOP(0.0285±0.0057)、BIP(0.3840±0.0389)、p-JNK(0.4588±0.1256)、Caspase-3(0.6349±0.1256)表达水平较低;高糖组RIN-m5f细胞中CHOP(0.0686±0.0081)、BIP(0.9862±0.1577)、p-JNK(2.1860±0.2356)、Caspase-3(2.3640±0.2238)表达水平较对照组明显增高(p<0.05);高糖+艾塞那肽组RIN-m5f细胞中CHOP(0.0495±0.0034)、BIP(0.3591±0.0641)、p-JNK(1.3530±0.0387)、Caspase-3(1.4210±0.3145)表达水平较高糖组则明显降低(p<0.05)。3.与对照组(17.51%)相比,高糖组(31.25%)细胞凋亡率明显上升(p<0.001);高糖+艾塞那肽组(19.52%)较高糖组的凋亡率明显下降(p<0.001)。结论:1.长时间间歇性高糖刺激可使胰岛β细胞活力下降,并且可诱发RIN-m5f细胞产生内质网应激。2.GLP-1类似物艾塞那肽可抑制细胞内质网应激,并通过调控细胞JNK信号通路来抑制胰岛β细胞凋亡。