论文部分内容阅读
选题依据:芸豆是一种古老的蔬菜作物和粮食作物,以味道鲜美、营养丰富而闻名。红芸豆（Phaseolus vulgaris L.）,又名红菜豆,是一种在全球范围内商业化生产和消费的食用豆。最近的研究表明,红芸豆具有抗氧化的生物活性。红芸豆中富含植物凝集素（PHA）,PHA已被发现具有抗肿瘤,抗真菌,抗病毒和α-葡萄糖苷酶抑制等一系列生物活性。黑色素瘤是一种由黑色素细胞引起的恶性肿瘤,其死亡率占皮肤癌死亡率的80%,且五年生存率低于5%。因此,寻找具有抑制黑色素瘤能力的药物刻不容缓。已有研究表明桑椹花色苷可抑制小鼠黑色素瘤细胞转移、柑橘汁提取物可抑制黑色素瘤细胞的增殖。红芸豆具有鲜红的种皮,其颜色可能在于其含有花色苷类成分,因此,我们推测红芸豆可能具有潜在的抗黑色素瘤作用。山西是红芸豆的主产区,为了进一步开发利用山西优质红芸豆资源,本研究拟对红芸豆抗黑色素瘤活性成分及其机制进行研究,为把红芸豆进一步开发为治疗黑色素瘤的潜在药物和功能食品提供依据。目的:本课题以山西特产红芸豆为研究对象,采用B16-F10小鼠黑色素瘤细胞模型,通过化学分析、细胞生物学、代谢组学、网络药理学和多元统计分析技术等多学科方法阐明红芸豆皮提取物抗黑色素瘤的活性成分和作用机制,为红芸豆的进一步开发奠定基础。方法:（1）通过1H-NMR及LC-MS分析,结合文献数据及标准品对照,分别对红芸豆皮及去皮种子提取物的化学成分进行结构鉴定。（2）采用小鼠黑色素瘤B16-F10细胞模型,首先通过观察红芸豆皮提取物（RKBC）和去皮种子提取物（RKBK）对细胞存活率、细胞迁移、细胞周期、细胞凋亡的影响进行抗黑色素瘤作用药效评价;其次,利用基于LC-MS的细胞代谢组学技术和网络药理学初步探究其抗黑色素瘤的作用机制;最后,采用Western blot对相关通路、靶点进行验证。（3）进一步将RKBC提取物分为石油醚（PE）、乙酸乙酯（EA）、正丁醇（BU）、剩余水层（W）四个萃取部位。通过分析四个萃取部位对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞的存活率、细胞迁移、细胞凋亡的影响,明确红芸豆皮抗黑色素瘤活性部位;采用液质联用、结合标准品对照对活性部位的化学成分进行定性分析,采用高效液相色谱和pH示差法对活性部位进行定量分析。（4）通过Western blot分析活性部位对细胞程序性死亡相关蛋白的作用,确认其可能的作用通路。对活性部位中鉴定的单体进行细胞存活率、细胞凋亡的药效评价,选择活性最佳的单体进行细胞程序性死亡相关通路的验证。结果:（1）采用NMR分析,从RKBC及RKBK提取物中共鉴定化合物29个,主要为氨基酸、糖和有机酸。采用LC-MS分析,从RKBC提取物中共鉴定化合物15个,主要为原花青素类、花色苷类及黄酮醇类成分;从RKBK提取物中共鉴定化合物5个,主要为大豆皂苷类。结果表明,RKBC和RKBK提取物具有相似的初级代谢物,但次级代谢物存在很大的差异。原花青素,黄酮醇类成分和花色苷类成分是RKBC提取物的主要成分,大豆皂甙则为RKBK提取物的主要成分。（2）RKBC提取物对B16-F10细胞抑制作用的IC50为36.93±2.74μg/mL,说明对B16-F10细胞具有明显的抑制作用;而RKBK提取物在6.25-200μg/mL的浓度范围内对B16-F10细胞无明显抑制作用。此外,RKBC提取物还可以浓度依赖性抑制细胞迁移,诱导G1期和G2/M期阻滞,并引发细胞凋亡和空泡化。细胞代谢组学结果表明RKBC提取物的抗黑色素瘤作用可能与嘌呤代谢有关。网络药理学结果显示RKBC可能通过调节CDK2和CDK4影响细胞周期。Western Blot分析发现RKBC可降低AKT1/2/3和cleaved-MMP2的水平,并上调Bcl-xl的表达。（3）EA、BU、W和PE四个部位均能抑制B16-F10细胞增殖,EA、BU和W在6.25-100μg/mL的浓度范围内的IC50分别为12.57±0.95μg/mL、11.71±4.44μg/mL、32.80±4.58μg/mL,而PE部位在此范围的最大抑制率仅为35%。从IC50值可以看出BU抑制B16-F10细胞增殖的活性最强,其次是EA、W和PE。细胞迁移、细胞凋亡、AO/EB和Hoechst 33342染色试验结果显示,BU部位在抑制细胞迁移和诱导细胞程序性死亡方面作用较强。活性部位定性分析结果显示,EA、BU和W的化学组成存在显著差异。EA部位以金丝桃苷和槲皮素为主,BU部位以保留时间为9.09 min的色谱峰和金丝桃苷为主,W部位以保留时间为2.63min和9.09 min的色谱峰为主。此外,保留时间为9.09 min的色谱峰通过液质联用分析推测为以槲皮素为母核的黄酮类成分,但具体结构未定。定量分析结果显示,EA、BU和W三个部位中金丝桃苷含量分别为3.534±0.055、1.716±0.008、0.930±0.003μg/μL,槲皮素含量分别为2.839±0.009、0.811±0.008、0.264±0.010μg/μL;总花色苷含量分别为0.374、0.227、0.107 mg/g。（4）Western blot分析显示BU部位对与细胞程序性死亡调控相关的AKT1/2/3,p-AKT1/2/3,PARP,Bim和Bcl-xl均有一定作用,说明BU部位可能通过影响AKT1/2/3-Bim通路和上调Bcl-xl的表达促进B16-F10细胞的程序性死亡。金丝桃苷、槲皮素和山柰酚的抗黑色素瘤活性结果显示,槲皮素(IC50为17.88±1.28μg/mL)的抗黑色素瘤活性最强,山柰酚次之,金丝桃苷最弱。Western blot的结果显示槲皮素对细胞程序性死亡的机制与BU部位相同。结论:本文通过NMR结合LC-MS分析,共鉴定出红芸豆提取物的55种化合物。发现RKBC提取物和RKBK提取物具有相似的初级代谢物,但次级代谢物存在显著差异。采用小鼠黑色素瘤细胞B16-F10模型证明红芸豆皮具有显著的抗黑色素瘤活性,而去皮种子无明显作用。进一步研究发现RKBC提取物发挥抗黑色素瘤作用可能通过抑制AKT1/2/3-MMP2通路从而抑制细胞迁移,抑制CDK2和CDK4的表达阻滞细胞周期,激活cGMP-PKG通路促进细胞凋亡,上调Bcl-xl的表达促进细胞空泡化等途径实现。进一步的活性部位筛选实验发现BU部位具有较强的抗黑色素瘤作用,其对细胞程序性死亡机制在于影响AKT1/2/3-Bim通路和上调Bcl-xl的表达诱导细胞程序性死亡进而抑制细胞增殖。BU中含有的槲皮素可能为RKBC提取物抑制黑色素瘤细胞增殖的主要活性成分之一。以上研究结果初步阐明红芸豆提取物抑制黑色素瘤细胞的活性成分和作用机制,为基于红芸豆的黑色素瘤治疗药物或功能食品研发奠定了基础。