第一部分：人颗粒溶素基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中表达的实验研究 颗粒溶素(granulysin，GNLY)是近年来发现的一种小分子蛋白，主要表达于激活的细胞毒T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)的细胞毒颗粒中，是发挥细胞毒作用的主要免疫效应分子之一。GNLY除了具有广谱抗菌活性，能呈剂量依赖性杀伤多种病原体，包括细菌、真菌和寄生虫外，对肿瘤细胞亦显示出很强的细胞毒活性。但不杀伤正常自身细胞。研究表明GNLY通过神经酰胺—caspases依赖性和非依赖性途径诱导靶细胞凋亡，不同于Fas或颗粒酶诱导的caspases依赖性细胞凋亡途径，提示GNLY在诱导肿瘤细胞凋亡中起着独特和互为补充的重要作用。GNLY作为天然的免疫效应分子，具有潜在的临床药用价值，其无免疫原性、无耐受性、天然、安全等优点使GNLY有望成为肿瘤治疗的理想候选药物。本研究旨在探讨GNLY基因在人肝癌细胞系表达所可能产生的影响。 用RT—PCR技术获取人GNLY全长编码序列cDNA，克隆到pGEM—T载体进行测序，再将克隆片段插入质粒pcDNA3.1(+)中，构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/GNLY，用阳离子聚合物转染试剂转染肝癌细胞系SMMC—7721，检测目的基因mRNA的表达，WST—8法检测细胞增殖活性。结果显示，获得了人GNLY全长编码序列cDNA，并成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/GNLY；转染SMMC—7721细胞后，检测出转染细胞中目的基因mRNA的表达；重组质粒转染组与空质粒对照组细胞增殖活性有显著性差异，并且随着转染重组质粒浓度的增加，细胞增殖活性逐渐降低，2.0μg/ml pcDNA3.1(+)/GNLY转染组细胞增殖活性下降到0.329。说明GNLY基因转染对SMMC—7721细胞能产生细胞毒效应，具有一定的杀伤作用。 第二部分：人精子蛋白17(hSp17)作为卵巢癌诊断指标及免疫治疗靶点的基础研究 卵巢癌恶性程度高，其死亡率居女性生殖系统肿瘤第一位。由于卵巢癌起病隐袭，无特殊症状，大多数上皮性卵巢癌患者就诊时已界晚期。虽然手术和化疗对卵巢癌患者有一定疗效，但是80％左右的晚期卵巢癌患者存活不足5年。如此差的预后，迫使医学界寻找新的诊断和治疗手段。由于肿瘤疫苗能够激活机体免疫系统杀死肿瘤细胞而避免导致明显的系统性毒副作用，免疫治疗正成为一种理想的卵巢癌治疗方法。研究和鉴定肿瘤免疫治疗合适的靶点正成为当前肿瘤治疗领域的一个研究热点。CT抗原包括一群异质的肿瘤相关抗原，表达于睾丸和多种肿瘤中，由于CT抗原在正常组织限制表达和高免疫原性，它们成为肿瘤免疫治疗理想的候选靶点。 精子蛋白17(sperm protein 17，Sp17)是新发现的一种CT抗原，是高度保守的睾丸组织特异性蛋白，人体其他正常组织极少表达Sp17。Sp17在受精时精子与卵子透明带的相互作用中起着关键作用。近期研究发现，Sp17在部分卵巢癌和多发性骨髓瘤组织以及其他一些肿瘤细胞系中异常表达。该蛋白在正常组织的局限性表达和在部分卵巢癌和多发性骨髓瘤以及其他一些肿瘤细胞系中异常 表达，使其成为卵巢癌等肿瘤免疫治疗的潜在靶点。 本文进行人Sp17(human Sp17，hSp17)作为卵巢癌诊断指标及免疫治疗靶点的基础研究。在前期成功制备Sp17单克隆抗体的基础上，又制备了hSp17多克隆抗体并建立血清hSp17双抗夹心ELISA检测方法，并对该法进行了初步的临床应用。结果显示，卵巢癌患者与正常人血清hSp17含量有显著差别(P＜0.01)，正常人血清中存在少量hSp17蛋白，而卵巢癌患者血清中hSp17含量明显升高者有39.3％。其次，构建Sp17基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/hSp17并将其转染卵巢癌HO—8910细胞，免疫细胞化学方法证实外源性hSp17基因能够在卵巢癌HO—8910细胞瞬时表达。然后，经G418连续筛选，并证实了外源性hSp17基因在卵巢癌HO—8910细胞中稳定表达，从而为研究hSp17蛋白在卵巢癌的发生发展中所起的作用提供了良好的hSp17蛋白表达系统，同时也为建立相应的卵巢癌动物模型，进一步研究hSp17作为卵巢癌诊断标志和免疫治疗靶点的临床价值奠定了基础。