论文部分内容阅读
研究背景肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,全球每年约新增肺癌病例180万例、死亡100万例,其较高的病死率一直受世界医疗组织广泛关注。肺癌按照其病理和组织学主要分为两种亚型,非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC,包括鳞状细胞癌、大细胞癌、腺癌)和小细胞肺癌(SCLC),而其中非小细胞肺癌占肺癌的80%~85%,5年生存率<15%。NSCLC的临床表现比较复杂,其早期症状表型无突出辨别指征,患者甚至毫无异常察觉。因此临床上及时的早期诊断并不容易,在诊断初期时就已有约50%的患者表现出有远端转移灶的迹象。针对出现远端转移灶的NSCLC患者多采用以化疗为主并辅以其他方式的综合治疗,虽然能对晚期NSCLC患者生存期限起到一定积极作用,但在化疗杀死肿瘤细胞的过程中其靶向性差,对机体正常细胞造成重创。尤其对白细胞的伤害巨大,代谢的器官肝脏、肾脏在代谢过程也会受到很大程度的压力。且多数患者预后效果仍不理想,总体生存率(Overall Survival,OS)仍普遍偏低。近年来,随着医学分子生物学技术的发展,分子靶向治疗在晚期NSCLC中已成为重要的治疗手段被纳入NCCN(National Comprehensive Cancer Network,美国国立综合癌症网络)指南。针对NSCLC的新型分子靶向药物受到研究者广泛青睐,通过特异的靶向干预不仅显著提高了NSCLC患者的生存获益,而且与其他疗法相结合共同或辅助治疗更是开启了NSCLC治疗的新篇章。小分子化合物CCR5拮抗剂Nifeviroc通过干扰病毒与CCR5的结合可以达到抑制病毒融合和进入的目的,从而有效抑制HIV-1感染,临床上在抗HIV药物研发中发现了其抗肿瘤的作用。肿瘤生物学多项研究表明,肿瘤在机体中发生与发展的过程往往伴随出现细胞生物学行为的变化异常现象。据临床研究显示,CC族趋化因子受体5[Chemokine(C-C motif)receptor 5,CCR5]在NSCLC患者中异常高水平表达,并有作为预测不良预后指标的潜力。高表达的CCR5通过与其配体结合影响肿瘤微环境和肿瘤自身细胞,这提示CCR5很可能具备促进肿瘤功能。因此以CCR5为靶标的小分子拮抗剂有望在抗NSCLC作用方面发挥重要作用。研究目的在本研究中,基于前期实验室研究成果,进一步利用计算机辅助药物设计(Computer-aided drug design,CADD),深入探讨Nifeviroc和CCR5蛋白受体的作用模式;并研究Nifeviroc在CCR5基因敲降与过表达两种情况下对NSCLC A549细胞增殖和凋亡的影响,进一步分析验证CCR5可能是NSCLC治疗的重要靶点,为抗NSCLC分子靶向药物的研发提供理论支持。研究内容1.CCR5拮抗剂的对接研究:以CCR5为靶标,拟通过Discovery Studio2018、sybly-2.1软件中的Libdock、Surflex-Dock对接模块探究小分子拮抗剂Nifeviroc与CCR5蛋白受体的对接结合作用模式。2.借助慢病毒载体,构建CCR5基因沉默、过表达的稳转细胞株并检测其转染效率:对CCR5基因过表达与shRNA干扰慢病毒载体对转染后的A549细胞进行处理,采用Real-time PCR法、蛋白质免疫印迹法(Western Blot)分别从基因和蛋白水平检测过表达、沉默株的A549细胞转染效率。3.Nifeviroc联合过表达与沉默CCR5基因对NSCLC的A549细胞恶性增殖影响研究:采用CCK8法、细胞克隆形成实验、EdU检测、流式细胞术PI单染法细胞周期检测、Western Blot法比较过表达、沉默株的A549细胞经Nifeviroc处理后的增殖抑制情况,体外实验探讨Nifeviroc的作用靶点。4.Nifeviroc联合过表达与沉默CCR5基因对NSCLC的A549细胞凋亡初步研究:采用Hoechest染色观察细胞凋亡;流式细胞术Annexin V-APC/7-AAD双染细胞凋亡检测;Western Blot检测相关凋亡蛋白变化情况,比较经Nifeviroc处理后的对照组与过表达、沉默株细胞凋亡情况。研究结果1.小分子拮抗剂Nifeviroc与CCR5蛋白受体的对接打分高于其阳性对照Maraviroc对接打分;Nifeviroc与CCR5蛋白受体的TRP-86、GLU-283氨基酸残基之间以氢键的形式形成了稳定的结构。对接结果表明:结构稳定,对接良好。2.成功转染并构建沉默、过表达的A549稳转细胞株,转染效率测定显示:CCR5的核酸和蛋白表达量均有不同程度的降低或提高。3.小分子拮抗剂Nifeviroc能通过拮抗CCR5使A549细胞:(1)生存率下降(CCK8实验);(2)独立生存能力下降(平板克隆形成实验);(3)发生DNA合成的细胞数减少(EDU检测);(4)实现细胞周期阻滞(流式/WB分析),从而抑制A549细胞增殖。4.通过Hoechest染色观察、细胞流式术和相关促凋亡蛋白WB分析初步证实小分子拮抗剂Nifeviroc可通过拮抗CCR5从而促进A549细胞凋亡。