【摘 要】
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目的:利用合成生物学技术设计与构建p53突变型肿瘤特异性干预基因线路,并确定该基因线路对p53突变型肿瘤的实验性治疗作用及其特异性。方法:采用载体构建的方法构建可特异性结合野生型p53蛋白的适体核酶元件;采用双荧光素酶报告实验验证p53适体核酶在细胞中的活性与特异性;采用载体构建的方法构建Cre-p53适体核酶基因线路与CRISPR-p53适体核酶基因线路;采用荧光定量PCR法,荧光成像和蛋白质印
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目的:利用合成生物学技术设计与构建p53突变型肿瘤特异性干预基因线路,并确定该基因线路对p53突变型肿瘤的实验性治疗作用及其特异性。方法:采用载体构建的方法构建可特异性结合野生型p53蛋白的适体核酶元件;采用双荧光素酶报告实验验证p53适体核酶在细胞中的活性与特异性;采用载体构建的方法构建Cre-p53适体核酶基因线路与CRISPR-p53适体核酶基因线路;采用荧光定量PCR法,荧光成像和蛋白质印迹法（Western blot）检测Cre-p53适体核酶基因线路诱导DTA（diphtheria toxin part A,白喉毒素A片段）在p53突变肿瘤细胞系中的表达情况及CRISPR-p53适体核酶基因线路诱导p53蛋白在p53缺失肿瘤细胞系中的表达情况;采用CCK-8法,流式细胞术和Western blot实验检测Cre-p53适体核酶基因线路和CRISPR-p53适体核酶基因线路对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响;采用裸鼠成瘤实验,检测Cre-p53适体核酶基因线路和CRISPR-p53适体核酶基因线路对裸鼠成瘤的影响。结果:Western blot 结果显示,HFF、293T、HCT116 p53+/+和 5637 细胞系有 p53总蛋白表达,HCT16 p53-/-,G361,SCL-1和Hela细胞中几乎无p53蛋白表达。双荧光素酶报告结果显示,p53适体核酶可显著降低p53野生型细胞（HFF,293T和HCT116+/+）中荧光素酶活性,但对缺乏野生型p53蛋白细胞（HCT16 p53-/-,5637,G361,SCL-1和Hela）中荧光素酶无明显影响,结果表明p53适体核酶核糖开关可特异性作用于野生型p53细胞,并激活核酶的自体剪切活性;Cre-p53适体核酶基因线路载体测序结果显示,载体全长序列构建正确,p53适体核酶元件序列插入位置准确;荧光定量PCR和western blot结果显示,在mRNA和蛋白水平,野生型p53蛋白缺失细胞中Cre-p53适体核酶基因线路可诱导DTA显著表达,而在HFF,293T和HCT116+/+细胞中DTA无明显表达。CCK-8实验和流式细胞术显示,Cre-p53适体核酶基因线路可显著抑制HCT16-/-,5637,G361,SCL-1和Hela细胞的增殖,促进其凋亡;裸鼠成瘤结果显示,Cre-p53适体核酶基因线路可显著抑制HCT16-/-,5637,G361,SCL-1和Hela瘤体的生长。CRISPR-p53适体核酶基因线路载体测序结果显示,载体全长序列构建正确,p53适体核酶元件序列插入位置准确;荧光定量PCR和Western blot结果显示,在mRNA和蛋白水平,野生型p53蛋白缺失细胞（5637,G361,SCL-1和Hela）中CRISPR-p53适体核酶基因线路可诱导p53显著表达,而在HFF,293T和HCT116+/+细胞中对p53表达无明显影响;CCK-8实验和流式细胞术显示,CRISPR-p53适体核酶基因线路可显著抑制G361,SCL-1和Hela细胞的增殖,促进其凋亡,裸鼠成瘤结果显示,CRISPR-p53适体核酶基因线路可显著抑制G361,SCL-1和Hela瘤体的生长。结论:p53适体核酶可有效感应野生型p53蛋白信号并及时响应发生自体剪切,由p53适体核酶为主要元件构建的Cre-p53 aptazyme基因线路和CRISPR-p53 aptazyme基因线路可通过感应细胞内野生型p53蛋白进而靶向杀伤野生型p53蛋白缺失的肿瘤细胞,但对p53蛋白正常表达的细胞无影响。由p53适体核酶为核心构建的p53突变型肿瘤特异性干预基因线路的功能符合预期,作为一种新型肿瘤靶向治疗方法,该类基因线路具有肿瘤生物治疗的潜力。
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