论文部分内容阅读
水稻是我国最重要的粮食作物之一,在国民经济发展中占有不可替代的重要地位。而近年来水资源匮乏和频发性季节性干旱已成为影响水稻高产、稳产的重要因素。因此研究水稻的抗旱机制和提高水稻的抗旱性,对保证水稻高产、稳产具有重要的现实意义。近期大量的研究证明泛素化修饰在调控植物响应干旱胁迫过程中起到非常重要的作用,并且已有多种与干旱胁迫相关的E3连接酶和泛素化底物被成功的鉴定到。利用蛋白质组学挖掘水稻在响应干旱胁迫下的泛素化蛋白,并建立这些蛋白所参与的泛素化修饰调控网络,有利于系统地诠释泛素化修饰参与水稻抗旱调控机制,为挖掘更多的水稻耐旱基因奠定基础。由于泛素化蛋白在水稻中丰度低、存在时间短,直接在总蛋白水平鉴定泛素化修饰蛋白和E3连接酶效率比较低。为了高效地富集泛素相关蛋白,从水稻基因组中选取一个编码高效结合泛素的UBA结构域的基因,并将四个UBA结构域串联在一起,构建了一个GST-qUBAs诱饵蛋白。利用GST-qUBAs通过两步亲和法成功地从水稻叶片中富集到大量的泛素化蛋白,经过质谱鉴定和数据库比对后,一共成功地从GST-qUBAs富集到的样本中鉴定到134个泛素化蛋白,其鉴定泛素化蛋白的效率比直接在总蛋白水平鉴定泛素化蛋白提高了3倍以上,而且所鉴定到泛素化蛋白都至少含有一个明确的泛素化位点。根据以上的结果可以证实本文所构建的GST-qUBAs诱饵蛋白和建立的两步亲和富集法可以高效地富集和鉴定水稻体内的泛素化蛋白,为进一步研究泛素化修饰在植物发育过程中所起到的调控作用奠定了方法基础。利用GST-qUBAs诱饵蛋白和两步亲和法富集干旱胁迫处理前后水稻叶片中的泛素化修饰底物蛋白,一共成功的鉴定到与水稻抗旱相关的58个泛素化修饰蛋白和35个E3连接酶。在这些差异蛋白中除了大量未曾研究报道的E3连接酶和泛素化底物,还包含已经被相关研究报道的参与水稻抗旱胁迫的调控途径的E3连接酶如OsPUB15和OsCTR1以及泛素化底物如OsCP12和OsNek6。随后以这些差异蛋白为基础,通过分析他们与其他蛋白的相互作用,研究它们所在的调控和信号通路中的位置,初步构建了水稻响应干旱胁迫下的泛素化修饰调控网络,该网络一共含有2134个相互作用对。在这个初步网络虽然存在着大量的孤立的小网络,并且这些小网络之间的关联尚不明确,但是随着今后研究的逐步深入,蛋白与蛋白相互作用对不断被发现,这个初级网络将会得到进一步的完善,这也是本实验室今后研究的重要内容和方向。