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目的:以红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)为研究对象,紫草素和特比奈酚为阳性对照药,探讨地锦草有效成分鞣花酸抗红色毛癣菌活性,研究其对真菌细胞超微结构、细胞凋亡及其细胞生物合成相关基因表达量的影响,阐明其抗真菌作用的机制,为深入研究鞣花酸抗红色毛癣菌靶位和其开发利用奠定基础,为其临床应用治疗皮肤癣菌病提供科学依据。 方法:⑴采用美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案(M38-A),测定地锦草有效成分鞣花酸及其不同提取部位对4株红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、石膏样毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、白色念珠菌(Candida albicans)、近平滑念珠菌(Candida prapsilosis)临床常见真菌的MIC值,确定其抗真菌谱,筛选出对其敏感的真菌菌株。参考MIC结果,进一步测定鞣花酸对红色毛癣菌细胞生长抑制率。⑵鞣花酸作用于红色毛癣菌(T.rubrum)后,按常规方法进行样品处理,利用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM),观察其对红色毛癣菌细胞表面形态结构的影响。⑶鞣花酸作用于红色毛癣菌后,分离菌丝样品,经过洗涤、染色等样品前处理后,设低(64μg·mL-1)、中(128μg·mL-1)、高(256μg·mL-1)剂量组,采用AinexinV-FITC/PI双染法考察其对红色毛癣菌细胞凋亡的影响。⑷鞣花酸作用于红色毛癣菌后,采用RT-PCR方法检测其对真菌细胞膜麦角甾醇生物合成通路有关ERG11、SUB1、MEP4、ERG6等基因表达的影响。 结果:①鞣花酸对念珠菌的平均MIC值为256μg·mL-1、对石膏样毛癣菌的平均MIC值为128μg·mL-1,其中对红色毛癣菌最为敏感,平均MIC值为64μg·mL-1。地锦草有效部位对红色毛癣菌(T. rubrum)、石膏样毛癣菌(T. mentagrophytes)的平均MIC值大于1024μg·mL-1,对近平滑念珠菌(C. parapsilosis)、白色念珠菌(C. albicans)的平均MIC均大于2048μg·mL-1;②扫描电子显微镜(SEM)下观察,鞣花酸(64μg·mL-1)作用于红色毛癣菌后真菌细胞表面皱缩不平,明显变形膨胀,且可见表层剥离,菌丝破裂,呈粘糊状,细胞内容物溢出;③鞣花酸作用于红色毛癣菌后,鞣花酸低、中、高浓度的细胞坏死率依次为:16.6%、20.6%、27.3%。④鞣花酸低、中、高剂量的诱导下MEP4、SUB1和ERG11基因的表达量下调分别为0.1526、0.0726、0.0585,0.2093、0.1331、0.0857,0.0791、0.0423、0.0400等不同浓度的鞣花酸对ERG6的上调表达量分别为2.6950、4.1398、4.8764。差异有显著性(P<0.05)。 结论:鞣花酸具有显著的抗真菌活性,对浅部致病真菌有较强的抑制作用,其中对红色毛癣菌最敏感。可抑制红色毛癣菌生长,通过破坏真菌细胞膜的结构,诱导其坏死,其机制可能是麦角甾醇生物合成相关的MEP4、SUB1、ERG11基因相对表达量的下调,ERG6基因相对表达量的上调有关。