原发性肝癌(HCC)恶性程度高，发病快，就诊时常属中晚期，手术切除率低，肝癌肝切除术后的5年复发率43％～61％，5年生存率为35％～42％，预后差。治疗的主要难点是肿瘤的高度复发倾向和转移。随着分子生物学、肿瘤免疫治疗学的发展，人们不断寻找新的有效治疗方法。 随着人们对肿瘤免疫学认识的不断深入，愈来愈多的研究显示肿瘤免疫治疗是一种行之有效的治疗手段。目前，肿瘤免疫治疗主要包括细胞因子治疗，过继性免疫治疗，导向治疗，肿瘤疫苗诱导的主动免疫等方面。随着肿瘤免疫治疗研究和分子生物学技术的发展，近期人们认识到，细菌DNA含有的或人工合成的CpG寡脱氧核苷酸(cytosine-phosphorothioate-guanine oligodeoxynucleotide，CpG ODN)，当其和肿瘤抗原结合时，具有强大的免疫刺激作用；另一方面微波消融(mirowave ablation，MA)已成为原发性肝癌的重要治疗手段之一，但同手术切除一样，MA治疗HCC，也存在治疗后复发的问题，但与手术不同的是，经MA治疗后肿瘤抗原仍存在，因此，将CpG ODN与MA结合起来，有可能提高免疫效应，增强其治疗肝癌的效果，本研究围绕MA及其与CpG ODN的联合治疗肝癌进行，旨在找到进一步提高MA治疗肝癌效果的新途径。 第一部分不同温度微波消融肝癌的病理组织变化 比较HE染色和NADH．diaphorase酶组织化学染色，对判断MA灭活肝癌组织效果的价值，揭示MA灭活肝癌的病理组织学特点，并确定有效灭活小鼠肝癌的消融温度，为后续研究确定消融温度提供依据。 方法 分别用60℃，3min、55℃，3min、50℃，3min、45℃，3min不同条件的微波消融，依次治疗A、B、C、D各组小鼠移植型肝癌，取微波消融前、消融后即刻及两周时的肿瘤组织标本制成石蜡和冰冻切片，进行常规HE染色及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶(nicotinamide adenine dinucleotide diaphorase．NADH-diaphorase)的酶组织化学染色，在显微镜下观察两种染色的情况，并观察各组治疗后的肿瘤残余情况。 结果 从HE染色观察，A、B、C、D各组小鼠肝癌组织在微波消融后的即刻，其细胞核形态和排列较消融前无明显改变；酶组织化学染色显示，A、B组肿瘤消融区内的NADH-diaphorase的活性均消失，说明癌细胞的灭活；C、D组肿瘤消融区内上述的酶活性呈散在阳性，提示部分癌细胞仍存活；A、B组与C、D组的肿瘤灭活效果明显不同(P<0.01)；在消融后两周，A、B组消融肿瘤组织呈坏死干痂样物，HE染色为无细胞结构坏死物，酶组织化学染色显示无NADH-diaphorase活性；C、D组有肿瘤残留，HE染色显示有肿瘤细胞结构及部分坏死，酶组织化学染色提示有部分NADH-diaphorase活性；肿瘤残余情况：A组0／8、B组1／9、C组7／9、D组8／8，A和B组与C和D组间肿瘤治愈率有显著差别(P<0.01)。 结论 HE染色不能评价微波消融对肝癌的即刻灭活效应，用酶组织化学染色测NADH-diaphorase的酶活性能判定微波消融对肝癌的灭活效果；微波消融小鼠肝癌，对癌细胞结构有形态上“热固定”的作用；A和B组的消融条件能有效灭活小鼠的移植型肝痛。 第二部分 单纯微波消融肝癌对荷瘤鼠抗肿瘤免疫的影响 探讨小鼠肝癌微波消融对宿主免疫细胞组成和细胞因子分泌的影响，以及对再次接种肿瘤的抵抗能力，初步检测单纯微波消融所产生的抗肿瘤免疫效应。 方法 运用已建立C57BL／6J小鼠Hepal-6细胞移植肝癌模型，对肿瘤微波消融(MA组)或手术切除(手术组)，分别用流式细胞仪和ELISA法检测治疗前(荷瘤组)、和治疗后两周及三周宿主周围血CD4+、CD8+、NK1.1+细胞组成(％)及血浆Th1细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ和Th2细胞因子IL-4、IL-10的水平(pg／ml)，以及治疗后两周各组再接种肿瘤的成瘤率。 结果 荷瘤组比正常组CD8+、CD4+T细胞下降，NK1.1+细胞增加，细胞因子IL-2、IL-10增加，IL-4、IL-12和IFN-γ下降(均P>0.05)。MA组较荷瘤组CD8+、CD4+T细胞增加(均P>0.05)，NK1.1+细胞明显升高(P<0.05)，IL-12、IFN-γ显著上升(均P<0.01)，IL-4明显降低(P<0.05)，IL-10降低(P>0.05)。手术组比荷瘤组CD8+、CD4+T细胞升高，NK1.1+细胞降低，IL-2、IL-12、IFN-γ上升，IL-4和IL-10有所下降(均P>0.05)。MA组比手术组CD8+、CD4+T细胞升高(均P>0.05)，NK1.1+细胞、IL-12明显上升(P<0.01、P<0.05)，IL-2、IFN-γ升高，IL-4、IL-10下降(均P>0.05)；再接种相同浓度肿瘤细胞时，MA组较荷瘤组成瘤率明显降低(16.7％VS 66.7％，P<0.05)，但与手术组相比无显著区别(16.7％VS 25％，P>0.05)。 结论 MA原位灭活小鼠肝癌可促进Th2／Th1偏移及NK细胞组成的显著升高，但抗肿瘤再生长能力较手术组无明显区别。 第三部分 微波消融联合CpG ODN治疗肝癌的效果 从第二部分试验结果可知，单纯MA治疗小鼠肝癌，在一定时间内，激发的抗肿瘤免疫效应有限，本部分实验利用微波消融肝癌后仍留有抗原，而CpG ODN结合肿瘤抗原可激起机体较强免疫效应的特点，探讨将二者结合起来，进一步提高治疗肝癌的效果的途径，以减少HCC经MA治疗后的残留或复发。 方法 1．实验分组及处理：将荷瘤小鼠分为A(微波消融+局部注射CpG ODN)、B(单纯局部注射CpG ODN)、C(单纯微波消融)和D(对照)共四组，给予下面的处理即：微波消融，采用45℃，3min的消融条件消融A、C组小鼠；肿瘤局部注射CpG ODN，将CpG ODNl826和ODNl982溶于生理盐水中，使浓度为500μg／ml，于实验的0、3、6、9天，按50μg／只，给A、B组小鼠瘤周注射CpG ODN1826，给D组小鼠瘤周注射ODN1982。 2．免疫学检测：于治疗后的第12天，每组取6只小鼠，摘除眼球取血入EDTA.K2抗凝管中，流式细胞仪检测血液中的CD4+、CD8+和NK1.1+细胞，用ELISA法检测鼠血浆中细胞因子IL-10、IFN-γ；摘除脾脏，用MTT法测脾淋巴细胞的杀伤活性；切除肿瘤组织，制做5μm冰冻切片，免疫组化法检测肿瘤组织中浸润的CD4+、CD8+和NKl.1+细胞，剩余鼠用于观察治疗后3周时的肿瘤残留率。 结果 A组血液中的CD4+、CD8+和NK1.1+细胞较其他组升高而明显高于对照组(P<0.05)；A组的血浆中的细胞因子：IFN-γ浓度也显著高于其他组(P<0.05或P<0.01)；淋巴细胞杀伤试验结果显示，A组的脾淋巴细胞对靶细胞的杀伤率明显高于其他组(P<0.05或P<0.01)；免疫组化结果标明，A组肿瘤组织中浸润的淋巴细胞也较其他组明显增多(P<0.01)；治疗后三周，各组肿瘤的残留情况：A组，1／9；B组，6／9；C组，9／9；D组，9／9。A组的治疗效果显著高于另外组(P<0.05或P<0.01))。 结论 微波消融联合CpG ODN治疗小鼠移植型肝癌，能够明显增强荷瘤鼠的抗肿瘤免疫，显著提高对MA后残余癌的杀灭，因而，可能有助于减少MA治疗肝癌后的复发。 总结 1．通过比较HE染色和NADH-diaphorase的酶组织化学染色对MA消融肝癌效果的判断，显示肝癌经MA后即刻所发生的主要变化不是形态学方面的，而是NADH-diaphorase活性的明显变化，即MA灭活肝癌组织对其细胞形态具有即刻的“热固定”作用，因此，HE染色不适合评价MA对肝癌的即刻灭活效果，采用NADH-diaphorase的酶组织化学染色能较好地显示这种即时灭活效应，并有助于确定有效的微波消融温度。 2．单独的MA激活的抗肿瘤免疫有限，MA结合CpG ODN的肿瘤局部注射，可显著增强MA的免疫刺激效应，包括全身和局部的免疫效应，免疫细胞和细胞因子以及淋巴细胞的杀伤活性，从而提高了MA对于残余癌的杀灭效果，所以可能有助减少MA治疗肝癌后的残余或复发。