柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是柑橘产业上一种系统性的毁灭性病害,其病原菌是专性寄生于韧皮部筛管组织中的革兰氏阴性细菌Candidatus Liberibacter,至今无法人工离体培养。其中,亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticu’,CLas)是黄龙病的主要致病种。柑橘黄龙病的典型症状为叶片斑驳黄化,一般认为病原菌侵染柑橘后会引起叶脉韧皮部堵塞,从而阻碍光合产物运输,导致叶绿体淀粉过渡积累而破坏叶绿体,最终产生斑驳黄化现象。于此同时,植株感病后碳水化合物由上向下运输受阻,根中碳水化合物匮乏,使得根部开始腐烂。然而,有研究认为,黄龙病菌侵染柑橘后最先在根中定殖,根部腐烂并不是碳水化合物缺乏导致的,而是由于根中黄龙病细菌的破坏所引起的。反过来,根系的稳定是否与地上部分耐病性紧密相关,比如根系的稳定性影响N、Fe、Mg、Zn等矿质元素的吸收与运输,而这些矿质元素参与了叶绿素的合成,任一元素减少后都会导致黄化症状。感病后地上部分和地下部分之间的这种恶性循环,最终引起病树死亡。显然,柑橘根与叶是如何协同应答黄龙病菌侵染,是根还是叶起主导作用有待深入研究。另外,在黄龙病菌侵染柑橘根和叶中,病原菌致病机制依然不清楚。因此,为了解析黄龙病菌与柑橘根和叶互作的机制,本研究以易感病品种锦橙为试材,利用叶圆片嫁接方法进行黄龙病菌传毒,对感病后不同时期根和叶中病原菌增殖、淀粉含量变化、胼胝体沉积特征、病变的解剖结构特征进行分析,进一步,利用TMT标记技术对根和叶进行蛋白组测序,研究病原菌侵染后寄主与病原菌在蛋白组水平的变化特征和互作的分子机制,以期阐明黄龙病菌与柑橘互作的内在机制,为挖掘关键抗(感)基因用于柑橘抗病育种提供理论参考。具体研究结果如下:1、病原菌在晚锦橙根和叶中的扩散特征比较在传毒10个月内,病原菌含量在叶脉中逐渐增加,而根中的病原菌含量从第2个月到第6个月逐渐增加,但在第10个月时,病原菌含量下降。在第2个月和第6个月时,根中的病原菌含量都略高于叶脉中的病原菌含量,第10个月时,叶脉中病原菌含量显著高于根中。2、感病后晚锦橙根和叶的响应特征比较在嫁接后早期阶段(第2个月时),与对照相比,感病植株叶片和根在症状、解剖结构、淀粉粒积累和胼胝体沉积等方面没有明显变化。在后期(第6、10个月)时,感病植株根部腐烂严重,叶片出现黄化症状;根和叶中淀粉含量显著增加,韧皮部外薄壁细胞中淀粉粒积累明显增加;叶脉韧皮部中胼胝体沉积显著增加,但根中无明显变化。第十个月时,叶脉韧皮部加厚,表皮细胞染色加深。3、早期感病晚锦橙根和叶蛋白组测序分析在感病早期(第2个月)时,对根和叶脉进行蛋白质测序分析。共鉴定到7779个宿主蛋白质,其中6759个蛋白质包含定量信息。以1.5倍为变化阈值,t-test p-value<0.05为标准筛选差异蛋白,叶脉中有43个蛋白上调表达,85个蛋白下调表达;根中有183个蛋白上调表达,97个蛋白下调表达。同时鉴定到38个病原蛋白,其中差异表达蛋白6个。4、寄主蛋白组响应CLas感染的变化特征蛋白数据表明,根中响应黄龙病侵染的蛋白数量明显多于叶脉;KEGG富集结果表明,叶脉中有较多蛋白富集在糖代谢通路中,根中有较多蛋白富集在次生代谢物的合成以及苯丙素的合成代谢通路中;从差异表达基因结果可以看出,鉴定到大量过氧化物酶、几丁质酶等病程相关蛋白。结果表明,在黄龙病感染柑橘早期,叶脉主要通过糖代谢相关通路应答CLas侵染,而根主要通过次生代谢相关通路响应CLas侵染。5、病原菌蛋白组的变化特征病原菌蛋白GO功能注释显示,注释的病原菌蛋白功能主要为转运活性和核酸相关功能蛋白。蛋白网络互作分析结果显示这些蛋白与细胞的生长发育和蛋白质折叠密切相关。在鉴定到的六个显著表达的病原菌蛋白中,有2个显著上调表达,4个显著下调表达。这些蛋白主要与细胞增殖与凋亡、能量代谢和物质跨膜运输密切相关。结果暗示,CLas主要通过调控物质跨膜运输和能量代谢来维持病原细胞在柑橘中的增殖和扩散。6、CLas诱导差异蛋白基因表达的定量分析用q-PCR对差异蛋白基因受CLas侵染的表达特征进行分析,分析的66个寄主差异蛋白基因中,23个上调蛋白基因表达量上调,9个上调蛋白基因表达量下调,6个下调蛋白基因表达量上调,28个下调蛋白基因表达量下调。病原蛋白中有13个上调蛋白的基因表达量上调;15个下调蛋白的基因表达量上调。7、Zn代谢在柑橘与黄龙病菌互作中的响应机制初探基因表达分析表明,与Zn离子代谢相关的宿主差异蛋白乙醇脱氢酶CsADH1基因和病原菌差异蛋白LasmalE基因可能参与柑橘与黄龙病菌互作中的Zn代谢调控。生物信息学分析显示CsADH1蛋白含有一个锌元素结合位点;外施激素SA、MeSA、IAA、ABA和锌离子明显诱导CsADH1表达,在根中CsADH1受激素和锌离子影响显著高于叶片,暗示CsADH1在柑橘根中响应逆境危害中起着重要作用。病原蛋白中ABC transporter家族的malE(通透酶)在维持膜内外的不对称性和渗透压,调控物质跨膜运输中至关重要,并且q-PCR结果显示,该基因在感病根中的表达水平显著高于感病叶脉。结果暗示,宿主CsADH1和病原LasmalE基因可能在根Zn离子代谢响应病原菌侵染中起重要作用。综上所述,在黄龙病菌与柑橘互作早期,寄主叶脉和根分别调控糖代谢和次生代谢相关通路响应CLas侵染,而CLas通过调控物质跨膜运输和能量代谢来维持病原细胞在柑橘中的增殖和扩散,暗示协调病原菌与寄主之间物质和能量的动态平衡可能是有效降低CLas危害和提升柑橘耐性病的关键。