弓形虫宿主范围广泛,生活史复杂,在终末宿主体内进行有性生殖,在中间宿主体内进行无性生殖,不同生殖阶段的虫体的代谢活性和机制不尽相同。有研究表明,弓形虫胞内、胞外和体内、体外的物质能量代谢也不同。复杂的寄生环境、多变的感染形式要求弓形虫必须具备灵活的代谢能力,使其可以根据环境变化来调控自身代谢进程来满足寄生生活的需要。那么,弓形虫是如何感受外界复杂的寄生环境变化?又如何调节自身代谢活动去适应不同环境的物质能量需求?在哺乳动物和酵母中,AMPK（AMP-activated protein kinase）是一个由α催化亚基、β调节亚基和γ调节亚基组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物,是细胞中的能量感受器,调节多种代谢通路以维持细胞内的能量稳态。AMPK复合物的活性受到AMP:ATP和ADP:ATP相对水平的调节,而γ亚基具有这三者的竞争性结合位点——CBS域。分析发现弓形虫中有一个AMPKγ亚基,其含有2个保守的CBS域。目前,还没有关于弓形虫AMPK代谢活动的研究,本课题以AMPKγ为切入点,研究了AMPK对弓形虫代谢活动的影响及其作用机制,以阐明虫体如何调节自身代谢以满足变化环境下的物质能量需求。具体研究内容如下:1、AMPKγ对弓形虫速殖子的生长至关重要利用条件性蛋白降解系统（Mini-AID系统）得到了带有HA标签的iAMPKγ单克隆虫株,吲哚乙酸IAA的处理能够迅速诱导AMPKγ的降解,导致弓形虫生长受阻,说明AMPKγ对于弓形虫速殖子的生长至关重要。进一步研究发现,AMPKγ的降解使得弓形虫的滑行运动、微线体分泌、入侵、复制和ATP水平等都明显的下降,这说明AMPKγ对弓形虫速殖子的影响基本覆盖了速殖子裂解循环中的每一个步骤。2、AMPKγ通过影响AMPKα的磷酸化调控弓形虫的生长代谢γ亚基是AMPK复合物的调节亚基,可以影响催化亚基AMPKα的磷酸化状态。对AMPKγ降解前后速殖子AMPKα磷酸化状态进行检测发现:IAA处理48 h后,AMPKα磷酸化被显著抑制,说明AMPKγ的降解影响了AMPKα的磷酸化。序列比对分析发现弓形虫AMPKα的T221位点为磷酸化调节位点,对应人源AMPKα的T172位点。通过遗传改造弓形虫AMPKα的221位点,使其磷酸化状态表现为动态激活的T221T、持续激活的T221D或抑制激活的T221A。在iAMPKγ虫株表达这3种不同磷酸化状态的α亚基全长及对应的激酶域,并观察其体外生长表型。结果显示:条件性敲除AMPKγ后,T221T虫株的包括入侵能力、ATP水平、复制和新蛋白合成能力在内的体外生长缺陷得以修复;T221D虫株的ATP水平和入侵能力得到恢复,但复制和蛋白合成缺陷不能被恢复;而T221A虫株及表达三种磷酸化状态的激酶域的虫株不改善AMPKγ降解后弓形虫的任何生长缺陷。由此推测AMPKγ可通过AMPKα影响弓形虫的生长发育。α亚基激酶域和全长蛋白的功能差异提示弓形虫AMPKα亚基存在激酶域之外的其他重要功能区。3、AMPK通过磷酸化下游靶标调控弓形虫的代谢活性为了更进一步分析AMPKγ的工作机制,我们首先进行了转录组学分析,比较了AMPKγ降解前后虫体基因表达的变化。结果发现AMPKγ的降解在短时间内对虫体基因表达没有太大影响,这说明AMPKγ可能不在转录水平对弓形虫的生命活动进行调控。鉴于AMPKγ降解对AMPKα磷酸化的抑制作用,我们对AMPKγ降解前后速殖子的蛋白磷酸化水平进行了检测。通过差异分析,总共筛选到333个磷酸化差异蛋白,其中171个磷酸化水平上升（缺失后/缺失前）,162个下降。对磷酸化差异的蛋白分别进行了GO通路分析和代谢通路分析,结果表明:差异蛋白与糖酵解通路、虫体内新蛋白合成、转运载体活性、磷脂相关代谢通路等生物进程相关。本研究通过对弓形虫AMPKγ的研究发现它对于弓形虫的生长非常重要,参与速殖子裂解循环中动态的能量和物质代谢调控。当速殖子释放到胞外后,为了满足激增的ATP需求,弓形虫AMPKα被磷酸化和激活,促进下游分解代谢快速产能。当速殖子入侵到胞内后,为了增殖会提高对大分子物质的合成需求,此时AMPKα磷酸化水平下降,合成代谢和分解代谢间取得较好的平衡。综上所述,弓形虫AMPK复合物可感受速殖子裂解循环中所面临的寄生环境的变化,及时调整期代谢进程来应对多变环境中的物质和能量需求。本研究为理解弓形虫无性生殖阶段的寄生机制提供了理论基础,为弓形虫病的防治提供了新靶标。