肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因,非小细胞肺癌（NSCLC）代表了该疾病的主要组织学亚型。小分子酪氨酸激酶抑制剂和免疫疗法是治疗NSCLC的常用手段,也为特定的患者带来了很大的生存益处,但由于NSCLC的高度异质性和耐药性,其总体的治愈率和存活率仍然很低。有证据显示肿瘤生长和繁殖的能力取决于肿瘤细胞的干细胞样特性,这种干性主要通过自我更新途径（Wnt/b-catenin、Notch和Hedgehog）的改变,或者对维持胚胎干细胞自我更新的主要转录因子（如Oct4、Sox2和Nanog）的调控来维持,使得肿瘤细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,进而能够逃避药物的治疗并发生转移。且多项研究表明,肿瘤细胞的干性在NSCLC的耐药、休眠、转移和复发中发挥至关重要的作用。因此,靶向影响肿瘤细胞干性的发育途径或将成为预防肿瘤耐药和治疗癌症的关键。FoxO3a作为转录因子除参与增殖、凋亡等细胞进程外,也可调控与干细胞维持、细胞分化和器官发育相关的生命发育过程。FoxO3a或将通过影响肿瘤细胞的干性维持而在肿瘤的耐药中发挥关键作用。在本课题中,我们探究了FoxO3a对NSCLC细胞耐药性的影响,并在此基础上研究了FoxO3a在NSCLC细胞迁移侵袭、集落形成、自我更新及表面干性标志物表达等肿瘤细胞干样特性中的作用,此外,还对其中可能涉及的机制进行了探索,以期通过靶向与肿瘤细胞干性相关的自我更新途径为解决NSCLC的耐药问题提供有希望的治疗策略。目的本研究通过检测FoxO3a在非小细胞肺癌细胞（NSCLC）系中的表达情况,分析其在NSCLC耐药中的作用,探讨FoxO3a对NSCLC细胞系耐药及肿瘤细胞干性特性的影响并进一步研究其调节机制。方法1.FoxO3a在NSCLC细胞中的表达qPCR和Western blot分别检测PC9、A549、H358、H1299和H1975共5种NSCLC细胞系中FoxO3a的mRNA和蛋白表达水平。2.不同NSCLC细胞对吉非替尼敏感性的比较MTT法检测PC9、A549、H358、H1299和H1975共5种NSCLC细胞系对吉非替尼的敏感性。绘制生长曲线,计算IC₅₀值,比较不同NSCLC细胞系对吉非替尼的敏感程度。3.FoxO3a对NSCLC细胞耐药性的影响为探究FoxO3a在NSCLC耐药中的作用,我们通过脂质体转染法将表达FoxO3a的质粒和FoxO3a特异性siRNA分别转染到PC9、A549和H1299细胞中,通过荧光观察、qPCR和Western blot验证转染效率。在确证转染细胞满足后续实验需要后,采用MTT实验检测FoxO3a改变后PC9、A549和H1299细胞对吉非替尼敏感性的变化,并绘制生长抑制曲线。4.FoxO3a对NSCLC细胞迁移侵袭的影响为探究FoxO3a对NSCLC肿瘤细胞干性稳态的调控作用,我们在改变FoxO3a表达后,对体现肿瘤细胞干性的指标进行了检测。本研究采用transwell实验对PC9、A549和H1299细胞的迁移侵袭能力进行了检测,并使用Image J软件对发生迁移侵袭的细胞数目进行了统计。5.FoxO3a对NSCLC细胞集落形成的影响在PC9、A549和H1299细胞中改变FoxO3a表达后,分别采用平板集落形成以及软琼脂集落形成实验检测各组细胞所形成集落的大小和数量,比较FoxO3a对PC9、A549和H1299细胞独立生长能力和锚定-非依赖性生长能力的影响。6.FoxO3a对NSCLC细胞自我更新能力的影响分别在PC9、A549和H1299细胞中过表达和沉默FoxO3a后,采用肿瘤球形成实验检测FoxO3a改变后各组细胞自我更新能力的变化。7.FoxO3a对NSCLC细胞表面干性标志物表达的影响分别在PC9、A549和H1299细胞中过表达和沉默FoxO3a后,选取CD133和CD44两种流式抗体作为NSCLC肿瘤细胞的干性标志物,染色后流式细胞仪检测各组细胞中CD133⁺CD44⁺细胞的占比情况。8.PC9细胞中FoxO3a对干性相关基因的调控作用在前期实验的基础上,利用pubmed对肿瘤干性相关的基因进行查询与归纳,筛选得到PRR11、NONO、RYBP、MYCN、HMG-2、IFITM1和LGR6七个干性相关基因。为探究FoxO3a对各基因的调控作用,在PC9细胞中过表达和沉默FoxO3a后,采用qPCR对各基因mRNA水平的表达进行检测。9.PC9细胞中FoxO3a对干性相关基因结合情况的预测与验证利用JASPAR数据库对通过qPCR筛选得到的3个干性相关基因进行FoxO3a潜在结合位点的预测,选取评分最高的结合位点进行ChIP引物设计,ChIP-qPCR和1%琼脂糖凝胶电泳验证FoxO3a对各干性相关基因的富集效率,观察FoxO3a与各基因启动子区的结合情况。结果1.NSCLC中FoxO3a在吉非替尼敏感株和耐药株中的表达不同PC9细胞是吉非替尼敏感株,A549、H358、H1299和H1975细胞是吉非替尼耐药株,qPCR和Western blot实验结果显示FoxO3a在耐药株H358、H1299、H1975和A549细胞中的mRNA和蛋白表达水平均低于敏感株PC9细胞（P<0.01）。2.不同NSCLC细胞系对吉非替尼的敏感性不同MTT实验结果显示吉非替尼对敏感株的生长抑制率明显高于耐药株,即PC9细胞对吉非替尼的敏感性明显高于其他NSCLC细胞系。3.FoxO3a增强NSCLC细胞对吉非替尼的敏感性MTT结果显示,过表达FoxO3a显著增强了吉非替尼对PC9细胞的浓度依赖性抑制,IC₅₀值减小,A549和H1299细胞对吉非替尼的IC₅₀值也减小;沉默FoxO3a后显著降低了吉非替尼对PC9细胞的浓度依赖性抑制,IC₅₀值增大,A549和H1299细胞对吉非替尼的IC₅₀值也增大。4.FoxO3a抑制PC9、A549和H1299细胞的迁移和侵袭性Transwell迁移结果显示,过表达FoxO3a后PC9、A549、H1299的迁移细胞数分别由对照组的249.0±29.1、473.3±38.4、248.7±17.8个减少到55.7±9.0（P<0.001）、53.0±1.0（P<0.01）、51.7±15.0（P<0.001）个;沉默FoxO3a后PC9、A549、H1299的迁移细胞数则分别由对照组的363.0±30.1、452.0±40.6、274.7±34.0个增加到477.0±44.2（P<0.05）、859.0±135.5（P<0.001）、684.7±40.2（P<0.001）个。Transwell侵袭结果显示,过表达FoxO3a后PC9、A549、H1299的侵袭细胞数分别由对照组的324.3±34.3、478.3±62.5、269.7±27.1个减少到122.7±10.1（P<0.001）、91.0±5.6（P<0.001）、50.0±43.1（P<0.001）个;沉默FoxO3a后PC9、A549、H1299的侵袭细胞数则分别由对照组的434.3±15.1、549.3±49.2、254.7±40.3个增加到686.7±26.2（P<0.001）、856.3±53.6（P<0.001）、487.3±45.8（P<0.001）个。5.FoxO3a抑制PC9、A549和H1299细胞集落形成的能力平板集落形成实验的结果显示,过表达FoxO3a后各组细胞所形成的集落相比于对照组更小,且PC9、A549、H1299三组细胞的集落数量也由对照组的112.0±11.3、440.0±36.6、75.7±6.0个减少到57.0±3.0（P<0.01）、187.7±4.9（P<0.01）、5.0±1.0（P<0.001）个;而沉默FoxO3a后各组细胞所形成的集落更大,且PC9、A549、H1299三组细胞的集落数量也由对照组的101.3±3.5、509.0±3.5、66.7±3.1个增加到210.3±12.5（P<0.001）、1392.3±4.5（P<0.001）、116.0±6.0（P<0.001）个。软琼脂集落形成实验的结果显示,与对照组相比,过表达FoxO3a后各组细胞所形成的集落更小,且PC9、A549、H1299三组细胞的集落数量也由对照组的42.0±4.0、69.3±6.1、49.3±6.5个减少到18.3±3.1（P<0.01）、34.7±0.6（P<0.001）、24.3±4.7（P<0.01）个;而沉默FoxO3a后各组细胞所形成的集落更大,且PC9、A549、H1299三组细胞的集落数量也由对照组的51.3±5.1、82.0±2.7、66.3±6.7个增加到88.0±4.6（P<0.001）、139.3±2.5（P<0.001）、91.0±4.6（P<0.01）个。6.FoxO3a抑制PC9、A549和H1299细胞的自我更新能力肿瘤球实验的结果显示,FoxO3a过表达显著降低了PC9、A549和H1299细胞的球体大小,球体数量也分别由5.0±1.0、6.7±2.1、8.0±1.0个减少到0.3±0.6、1.0±0.0、0.7±0.6（P<0.05）个;FoxO3a沉默后显著增加了各组细胞的球体大小,球体数量也分别由7.7±2.5、3.3±1.2、3.7±0.6个增加到15.3±4.2（P<0.05）、12.0±4.0（P<0.05）、20.3±2.5（P<0.05）个。7.FoxO3a影响PC9、A549和H1299细胞的干性标志的表达经流式分析仪检测发现,FoxO3a过表达后PC9、A549和H1299细胞中CD133⁺CD44⁺细胞群的占比分别从25.4%、74.7%、66.6%降低到15.4%、42.6%、29.5%;而FoxO3a沉默后各组细胞中该细胞群的占比分别从0.1%、0.3%、35.8%增加到1.1%、4.9%、62.4%。8.PC9细胞中FoxO3a调控干性相关基因的表达qPCR结果显示,FoxO3a促进PRR11和NONO mRNA水平的表达,抑制IFITM1 mRNA水平的表达;FoxO3a影响MYCN、HMG-2和LGR6 mRNA水平的表达,但调控趋势不一致;FoxO3a对RYBP mRNA水平的表达没有调控作用。可选取PRR11、NONO和IFITM1作为后续研究的重点。9.FoxO3a直接结合干性相关基因的启动子区JASPAR数据库的预测结果显示,FoxO3a在PRR11、NONO和IFITM1基因的启动子区存在潜在的结合位点。ChIP-qPCR以及1%琼脂糖凝胶电泳的验证结果显示,FoxO3a在各基因所选取的结合位点处均有较高的富集效率,且富集倍数（FoxO3a/IgG）均在5倍以上,视为ChIP阳性。结论1.FoxO3a在对吉非替尼敏感的NSCLC细胞中高表达,在对吉非替尼耐药的NSCLC细胞中低表达。2.FoxO3a增强NSCLC细胞对吉非替尼的敏感性。3.FoxO3a抑制NSCLC细胞的迁移侵袭、集落形成和自我更新能力以及表面干性标志物的表达。4.FoxO3a促进PRR11和NONO mRNA水平的表达,抑制IFITM1 mRNA水平的表达。5.FoxO3a直接结合PRR11、NONO和IFITM1基因的启动子区。