论文部分内容阅读
恶性肿瘤的生长、浸润和转移必须依靠肿瘤新生血管提供足够的营养，因此抑制或破坏肿瘤血管生成已成为近年来肿瘤治疗的新方法。血管内皮生长因子（VEGF）与表达在血管内皮细胞上的相应受体VEGFR2结合所引起的信号转导是血管生成中的限速步骤，在整个血管生成中发挥着关键作用。可溶性血管内皮生长因子受体2（sVEGFR2，在小鼠中被称为sflk1）可竞争性地结合VEGF，从而阻断VEGF与VEGFR2结合所引起的信号转导，抑制肿瘤细胞诱导的血管生成和肿瘤的生长。IFN-γ是细胞免疫应答中非常重要的效应因子，能诱导CTL应答及Th1细胞的分化，并且尚能直接抑制多种肿瘤的生长，同时它自身也有抑制肿瘤血管生成的作用。本所已经构建了pcDNA3.1（+）／sflk1-IFN-γ重组质粒，获得高效稳定表达的CHO细胞，并对其表达产物sflk1-IFN-γ融合蛋白的生物学活性进行了初步研究。目的：为了进一步研究sflk1-IFN-γ融合蛋白的结构、理化性质、生物学活性以及进行动物试验等，本实验对CHO细胞上清液中sflk1-IFN-γ融合蛋白进行分离与纯化，拟获得纯度较高的融合蛋白，并探讨真核细胞表达所蛋白的分离纯化方法。方法：大规模培养高效稳定表达sflk1-IFN-γ融合蛋白的CHO细胞，收集上清，经超滤、盐析或阴离子交换层析（IEX）方法进行初步的浓缩与分离，再经疏水层析（HIC）进行中度纯化及凝胶过滤（GF）精细纯化并采用SDS-PAGE电泳进行蛋白纯度的鉴定。结果：1．利用低血清（5％FCS）培养表达sflk1-IFN-γ融合蛋白的CHO细胞，收集的上清中总蛋白的浓度为1741±40μg／ml，sflk1的浓度为55.2±6.70ng／ml，纯度为2.72～3.64×10-3％，IFN-γ的浓度为1.4±0.78ng／ml，纯度为0.03～0.14×10-3％；2．通过盐析可将细胞上清液中的sflk1-IFN-γ融合蛋白中IFN-γ纯度提高13.25倍，回收率30.02％；利用超滤膜Biomax-30浓缩细胞上清液，可将细胞上清液中的sflk1-IFN-γ融合蛋白中IFN-γ纯度提高3.38倍，回收率35.1％；采用阴离子交换层析可将细胞上清液中的sflk1-IFN-γ融合蛋白中IFN-γ纯度提高4.18倍，回收率48％；3．经疏水层析中度纯化，可将细胞上清液中的sflk1-IFN-γ融合蛋白中sflk1纯度由4.37×10-3％提高到48×10-3％，回收率19.2％；4．经凝胶过滤精细纯化，可将疏水层析收集液中的sflk1-IFN-γ融合蛋白中sflk1纯度由48×10-3％提高到2.34％以上。结论：蛋白质初步浓缩后，再经疏水层析及凝胶过滤可将CHO细胞所表达的sflk1-IFN-γ融合蛋白的纯度提高500多倍，sflk1的纯度可达2.34％，本论文中采用的方法对于真核体系表达的蛋白有一定的纯化作用。