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第一部分TGF-β1对同种反应性T细胞增殖能力及CD25表达的影响[目的]研究TGF-β1对同种反应性T细胞增殖能力及CD25表达水平的影响。[方法]以丝裂霉素处理的Balb/C(H-2d)裸鼠脾细胞为刺激细胞,CFDA-SE标记的C57BL/6(H-2b)小鼠的T细胞为反应细胞进行混合淋巴细胞培养(mixed lymphocytes culture, MLC)。分别设立对照组(TGF-β1 0ng/ml)、低浓度组(TGF-β1 1.0ng/ml)、中等浓度组(TGF-β1 5.0ng/ml)和高浓度组(TGF-β1 10.0ng/ml)。MLC结束后利用Alamar Blue法检测T细胞增殖活性,流式细胞仪(FACS)检测CD3、CD25表达水平。同时设立IL-2组(TGF-β1 5.0ng/ml +外源性IL-2 100u/ml),以观测其对TGF-β1生物学效应的影响。[结果] TGF-β1可明显降低同种抗原活化T细胞的增殖反应强度(对照组vs低浓度组,p<0.05),而且随着TGF-β1剂量加大,免疫抑制能力增强(低浓度组vs中浓度组,p<0.05)。TGF-β1在抑制T细胞增殖的同时,也使得CD25+T细胞比例上调(对照组vs低浓度组,p<0.05),但并无明显的剂量依耐性。加入外源性IL-2后,T细胞增殖活性增强(IL-2组vs中浓度组,p<0.05),同时CD25+T细胞比例降低(IL-2组vs中浓度组,p<0.05)。[结论] TGF-β1可明显抑制同种抗原活化T细胞的增殖,并使CD25+T细胞表达增加,而外源性IL-2则可逆转TGF-β1的免疫抑制功能,下调CD25+T细胞比例,说明TGF-β1的生物学效应要受到外源性IL-2的影响。第二部分TGF-β1诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+调节性T细胞[目的]研究TGF-β1诱导CD4+CD25+调节性T细胞分化的能力及其相关机理。[方法] 1、利用丝裂霉素处理的Balb/C裸鼠脾细胞刺激C57BL/6小鼠T细胞,同时给予TGF-β1予以干预(按TGF-β1剂量不同设立4组:对照组,低浓度组,中浓度组和高浓度组),共同培养5天后,用流式细胞仪检测CD4+CD25+T细胞比例;同时用RT-PCR检测培养细胞中Foxp3的表达水平。2、在第一部分实验基础上,通过MACS分离获取C57BL/6小鼠CD4+CD25-T细胞,用同种抗原刺激后,给予TGF-β1干预,培养5天后分离CD4+CD25+T细胞,利用混合淋巴细胞培养系统检测其抑制淋巴细胞增殖的能力。[结果] T细胞经同种抗原刺激后,在中、高浓度TGF-β1诱导下CD4+CD25+T细胞比例均明显升高,Foxp3的表达水平也相应增加,与对照组相比有显著性差异(p<0.05)。TGF-β1可直接诱导CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+T细胞,转化后的CD4+CD25+T细胞能有效抑制淋巴细胞增殖。[结论] TGF-β1可诱导CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+Treg,促进其表达Foxp3,并能抑制淋巴细胞增殖。第三部分TGF-β1诱导的调节性T细胞体内输注延长小鼠皮肤移植物存活[目的]利用TGF-β1体外诱导na?ve T细胞分化为调节性T细胞,通过体内输注延长小鼠皮肤移植物存活时间,并研究其相关机理。[方法]根据诱导条件不同分为三组:对照组(加入IL-2培养的C57BL/6小鼠T细胞)、MLR组(经同种抗原刺激活化的C57BL/6小鼠T细胞)和TGF-β组(经同种抗原刺激活化的C57BL/6小鼠T细胞,同时加入5.0ng/ml TGF-β1诱导)。利用FACS检测CD4+CD25+T细胞比例,并用RT-PCR检测Foxp3的表达水平。建立小鼠皮肤移植模型,并于0、1、2和3d输注上述细胞,观察皮肤移植物存活时间。术后第9天,取部分受鼠行移植物病理检测,用FACS检测脾脏中Th1、Th2和CD4+CD25+Treg比例,并用Alamar Blue法检测淋巴细胞增殖能力。[结果] TGF-β组中CD4+CD25+T细胞比例高于对照组和MLR组(p<0.05),且其高表达Foxp3。将培养的细胞输注给受鼠后发现,输注MLR组细胞的受鼠其移植物平均存活时间(mean survival time, MST)为(9.4±1.3)d,低于对照组(p<0.05);而输注TGF-β组细胞小鼠MST为(22.8±1.9)d,较对照组和MLR组明显延长(p<0.05)。病理检测亦显示TGF-β组受鼠移植物结构完整,无明显淋巴细胞浸润。FACS结果显示TGF-β组小鼠体内Th1细胞(CD4+TIM-3+)比例低于对照组和MLR组(p<0.05),而Th2细胞(CD4+TIM-1+)比例则与MLR组类似(p>0.05),但低于对照组(p<0.05);而且TGF-β组中CD4+CD25+Treg比例明显高于对照组和MLR组(p<0.05)。用Alamar Blue法检测受鼠外周淋巴细胞增殖活性显示,TGF-β组受鼠淋巴细胞增殖能力被明显抑制,低于对照组(p<0.05)。[结论] TGF-β1可诱导T细胞分化为具有抑制能力的调节性T细胞,将诱导后的细胞进行过继输注可使小鼠体内CD4+CD25+Treg比例升高,同时抑制Th1和Th2细胞分化扩增,并使得外周淋巴细胞增殖能力减弱,从而延长小鼠皮肤移植物存活时间。第四部分调节性T细胞通过TIM-3-TIM-3L通路抑制淋巴细胞增殖[目的]研究TIM-3-TIM-3L通路在调节性T细胞免疫抑制效应中的作用。[方法]用MACS从成年C57BL/6分离获取天然调节性T细胞(natural Treg, nTreg),并利用TGF-β1诱导na?ve T细胞分化为诱导性调节性T细胞(induced Treg, iTreg),随后通过RT-PCR检测其表达Foxp3和TIM-3L的水平,及其对淋巴细胞增殖的抑制能力。使用TIM-3融合蛋白(TIM-3.Ig)和anti-TIM-3处理nTreg和iTreg,对TIM-3-TIM-3L通路进行阻断,随后利用MLC体系检测其免疫抑制能力的变化情况。[结果]分离获取的nTreg和iTreg均可表达Foxp3。TIM-3L(galectin-9)在脾细胞高表达,同时在nTreg和iTreg也检测到有galectin-9表达,但表达水平低于脾细胞(p<0.05)。用TIM-3.Ig对nTreg和iTreg进行干预后发现,nTreg和iTreg抑制淋巴细胞增殖的能力部分减弱,与未干预组差异显著(p<0.05),但nTreg和iTreg之间无差异(p>0.05);而用anti-TIM-3处理nTreg和iTreg后并未明显减弱其抑制淋巴细胞增殖的能力(p>0.05)。[结论] TGF-β1可诱导iTreg产生。nTreg和iTreg均表达TIM-3L,并可通过TIM-3-TIM-3L通路抑制淋巴细胞增殖;但阻断TIM-3-TIM-3L通路后Treg仍可部分抑制淋巴细胞增殖,表明TIM-3-TIM-3L通路不是Treg发挥免疫抑制效应的唯一通路。