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口腔癌是头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一,其中鳞状细胞癌(SCC)是口腔中最常见的恶性肿瘤。随着科学技术的发展以及对口腔癌发病机制研究的深入,口腔癌的治疗水平获得了长足的进步,然而近几十年口腔癌患者,特别是鳞状细胞癌患者,5年生存率提高甚微,仍然只有60%左右。复发及转移是导致口腔鳞状细胞癌患者不良预后的主要原因。对口腔鳞状细胞癌的转移及复发机制进行深入研究,能够为口腔鳞状细胞癌的预防及治疗提供新的策略。细胞融合在人的正常生理过程中发挥重要作用,然而细胞融合与肿瘤的关系研究较少。最近的实验及临床研究发现,细胞融合可能与肿瘤发展的各个阶段都具有紧密联系,例如,可能参与了肿瘤的异质性及起始、肿瘤干细胞的起源、多耐药性及高转移潜能的获得等过程。本文从口腔鳞状细胞癌(OSCC)／内皮细胞(EC)融合的角度出发,试图提示细胞融合的分子机制及其在肿瘤微环境下中的潜在作用。主要研究内容如下：①从体外寻找OSCC/EC自发性融合的证据并加以鉴定；②探索研究OSCC/EC融合的机制及相关通路；③探索研究OSCC/EC融合细胞在肿瘤微环境中的潜在作用。实验一OSCC/EC体外自发性融合的检测及鉴定目的：探讨OSCC与EC在共培养条件下是否发生自发性融合。材料及方法：PKH26标记的内皮细胞(HUVEC)与CFSE标记的OSCC细胞系体外共培养24小时,荧光显微镜下观察双荧光标记细胞；在慢病毒转染体系下,HUVEC及OSCC细胞系分别转染绿色荧光蛋白(eGFP)和红色荧光蛋白(RFP),eGFP标记的HUVEC与RFP标记的OSCC体外共培养24小时,荧光显微镜下观察双荧光标记细胞；女性来源(XX)的HUVEC与男性来源(XY)的OSCC细胞系体外共培养24小时,Carnoy’s液固定后,荧光原位杂交(FISH)检测融合细胞。结果：PKH26标记的内皮细胞(HUVEC)与CFSE标记的OSCC田胞系体外共培养24小时,荧光显微镜下可见橙黄色的双荧光标记的细胞；在共培养体系下,eGFP标记的HUVEC与RFP标记的OSCC能够自发性融合形成双荧光标记的细胞,其双荧光细胞能够分裂增殖；女性来源(XX)的HUVEC与男性来源(XY)的OSCC体外共培养,FISH检测结果示同一细胞核中存在XXXY染色体,表明HUVEC与OSCC发生自发性融合,同时检测到部分细胞核含有XXXXXXYY染色体且细胞核处于分裂状态,表明融合细胞能够进行核重组且进行分裂增殖。Cal-27, SCC4及SCC9与内皮细胞之间的细胞融合率无显著统计学差异。结论：OSCC能够与EC发生自发性融合,此种融合细胞能够发生细胞核重组；重组之后的融合细胞能够分裂、增殖。实验二VCAM-1/VLA-4通路介导TNF-a促进的OSCC/EC融合目的：探讨TNF-a在OSCC与EC融合中的作用及VCAM-1/VLA-4是否介导OSCC/EC融合。材料及方法：免疫组织化学(IHC)用于检测口腔鳞状细胞癌组织标本中VLA-4及VCAM-1的表达；蛋白质免疫印迹(WesternBlot)从蛋白水平分别检测OSCC细胞系及HUVEC中VLA-4及VCAM-1的表达：在TNF-a刺激条件下,运用流式细胞仪及荧光标记法检测共培养体系中的细胞融合状况；通过抗体封闭实验验证VCAM-1/VLA-4通路在细胞融合中的作用。结果：IHC结果示：在口腔鳞状细胞癌组织标本中,肿瘤细胞表达VLA-4蛋白,组织标本中的血管表达VCAM-1; Westernblot从蛋白水平进一步检测发现OSCC细胞系表达VLA-4, TNF-a可诱导HUVEC中VCAM-1的表达上调；流式细胞仪及荧光标记法检测发现TNF-a能够明显提高OSCC/EC细胞融合率,而通过抗体封闭VLA-4及VCAM-1致使TNF-a的促融合作用受到明显抑制。结论：TNF-a能够促进OSCC-EC的融合；VCAM-1/VLA-4通路能够介导TNF-a的此种促融合作用。实验三OSCC/EC融合细胞在肿瘤微环境中的潜在作用目的：探讨OSCC/EC融合细胞的生物学特征及潜在作用。材料及方法：eGFP标记的HUVEC与RFP标记的OSCC体外共培养,先于多聚甲醛固定前在荧光显微下定位双荧光融合细胞(多聚甲醛固定后RFP荧光消失),分别用波形蛋白(Vimentin)及角蛋白(Cytokeratin)检测融合细胞中相关蛋白的表达；OSCC细胞系及融合细胞用顺铂(Cisplatin)30uM处理36小时,TUNNEL法检测OSCC细胞系及融合细胞的凋亡状态；OSCC细胞系与融合细胞混合注入裸鼠体内,一个月后取出瘤体,冰冻切片,eGFP及RFP双荧光染色法及FISH检测瘤体内的融合细胞。结果：免疫荧光检测结果示：融合细胞表达EMT相关蛋白Vimentin及上皮特异性蛋白Cytokeratin; OSCC细胞系及融合细胞用顺铂(Cisplatin)30uM处理36小时,TUNNEL检测结果表明OSCC细胞系中80%以上的肿瘤细胞发生凋亡,然而融合细胞的凋亡率约30%；在裸鼠体内实验中,eGFP/RFP双荧光染色法表明裸鼠瘤体冰冻切片标本中存在双荧光表达细胞,FISH法进一步检测发现XXXY融合细胞存在于瘤体标本中。结论：OSCC/EC融合能够获得亲代细胞的某些生物学表位,此种融合细胞具有更强的化疗药物抗性,从而使得OSCC-EC融合细胞能够具有更强的生存潜能。综上所述,在体外共培养条件下OSCC与EC能够自发性融合,OSCC/EC融合细胞能够发生核重组,继而维持分裂、增殖能力,且表达双亲细胞标记物,具有更强的Cisplatin药物抗性；炎症诱导因子TNF-a可通过VCAM-1/VLA-4通路促进OSCC/EC融合。