论文部分内容阅读
目的:研究二烯丙基三硫对急性髓细胞系白血病细胞株HL-60细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响并探讨其作用机制,为二烯丙基三硫用于临床防治癌症提供可靠的理论基础和实验依据。方法:将不同浓度的二烯丙基三硫与HL-60细胞体外共培养不同时间后: (1)采用Wright染色和荧光染色在光学显微镜和荧光显微镜下分别观察细胞形态学变化; (2)四甲基噻唑氮蓝(thiazolylblue tetrazolium bromide, MTT)法检测细胞生长抑制率; (3)流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测细胞周期分布和凋亡率; (4)用TRAP-PAGE银染法检测二烯丙基三硫作用前后细胞中端粒酶活性的改变; (5)免疫组化染色法检测细胞内bcl-2, Survivin,环氧合酶-2(cyclooxygenasa , COX-2)等蛋白的表达。(6)采用western blot法测定周期相关蛋白CyclinB1, CDK1表达水平。结果: (1)吖啶橙染色后于荧光显微镜下观察,对照组细胞核圆形,核仁可见,实验组经二烯丙基三硫处理后,凋亡细胞体积缩小,染色质浓聚,呈新月形或由膜包裹着染色质块形成凋亡小体凸起于细胞表面。Wright染色,可见正常细胞为圆形或卵圆形,核大而圆、居胞体中央,染色质分布均匀,有1-2个核仁,胞浆富含嗜苯胺蓝颗粒,二烯丙基三硫作用后细胞形态出现凋亡的特征,如胞浆中出现空泡,染色质固缩、核碎裂,且存在剂量依赖性。(2) MTT结果显示,二烯丙基三硫对HL-60细胞有明显的增殖抑制作用,与对照组比较有显著性差异(P<0.05),随着作用时间的延长、作用剂量的增大,抑制作用越明显。(3) FCM检测可见二烯丙基三硫影响HL-60细胞的细胞周期分布,使G2/M期细胞比例增高,具有剂量和时间依赖性,各组之间差异具有显著性(P<0.05)。FCM检测在G0/G1期前出现亚二倍体峰,即凋亡峰。(4) Annexin V-FITC试剂盒检测二烯丙基三硫诱导HL-60细胞的凋亡:终浓度10mg/L, 20mg/L的二烯丙基三硫分别与HL-60细胞作用24h,细胞的凋亡率(早期凋亡+晚期调亡)分别为27.36±3.46%和39.55±2.70%,作用48h,细胞的凋亡率分别为32.42±0.76%和60.57±3.24%。(5)二烯丙基三硫能明显抑制HL-60细胞端粒酶活性。银染条带显示结果:用终浓度10mg/L , 20mg/L , 30mg/L的二烯丙基三硫分别与HL-60细胞作用24h, 48h,细胞端粒酶活性明显下降,呈现出明显的时间和剂量的依赖性。(6)免疫组化染色法显示,随着二烯丙基三硫浓度的增大,HL-60细胞的bcl-2, Survivin, COX-2阳性表达逐渐减弱,阳性表达率也逐渐降低,各组之间差异均具有显著性(P<0.05)。(7)采用western blot法测定,20mg/L和30mg/L的二烯丙基三硫作用HL-60细胞后,细胞周期相关蛋白Cyclin B1的表达下调,对细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1表达无明显变化。结论:(1)二烯丙基三硫可导致人HL-60细胞形态发生改变。(2)二烯丙基三硫抑制HL-60细胞的生长和增殖,且存在时间和剂量依赖性。(3)二烯丙基三硫改变HL-60细胞的细胞周期分布,使细胞阻断在G2/M期,存在剂量和时间依赖性。(4)二烯丙基三硫可诱导HL-60细胞凋亡,也有剂量-时间效应关系。(5)二烯丙基三硫抑制HL-60细胞的生长、增殖及诱导HL-60细胞凋亡的机制与抑制HL-60细胞bcl-2, Survivin, COX-2的表达和抑制端粒酶活性有关。(6)二烯丙基三硫使细胞阻断在G2/M期的机制与下调细胞周期相关蛋白Cyclin B1的表达有关,而对细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1表达无明显变化。