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1目的地龙原动物参环毛蚓Pheretima aspergillum(E Perrier)来源于巨蚓科环毛蚓属,是药典所收载的4种地龙原动物之一,也是其中质量最优者。地龙药材因为其重金属含量超标问题在市场流通上难以走出国际市场,而研究发现MT-2基因是其重金属富集和代谢的最重要基因。MT-2基因受重金属诱导而产生金属硫蛋白(metallothionein, MT),金属硫蛋白与重金属结合从而发挥其解毒功能。对于金属硫蛋白,通过基因克隆和原核表达技术的应用,能够明确其重金属诱导机理；而使用基因步移技术,能够帮助阐明其上游调控部件的序列,这为将来制定重金属去富集方法,提高地龙药材质量打下了基础。2方法2.1参环毛蚓的采集和人工重金属诱导养殖野外采集参环毛蚓的活体样本,进行鉴别和分类,并对其进行实验室驯化性养殖,使其适应实验室的环境。摸索重金属镉(Cd2+)的有效诱导浓度,对参环毛蚓分组养殖,进行重金属胁迫处理。2.2RNA提取以及半定量RT-PCR提取蚓体消化道部分总RNA,进行半定量RT-PCR,通过电泳以及Quantity one软件分析考察其表达丰度及其与重金属诱导的相关性。2.3MT-2基因的克隆PCR扩增MT-2的cDNA,对PCR产物进行回收纯化,使用pGEM-T easy载体进行T-A克隆。经过蓝白斑分析以及菌液PCR筛选,选取阳性克隆进行测序,并分析其基因功能。2.4MT-2原核表达质粒的构建设计引物对克隆质粒进行ORF框的PCR, PCR产物进行双酶切(EcoR Ⅰ/Hind m)并连接至pET-32a(+),然后转化至DH5α,菌液PCR和双酶切鉴定,测序。2.5融合蛋白的表达提取PET-32a(+)-MT-2,转化至大肠杆菌BL21,使用氨苄青霉素抗性筛选以及酶切验证获得阳性菌落；接种单菌落,使用IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE对蛋白表达结果进行分析。对所表达的蛋白质进行蛋白质活性测试。2.6Tail-PCR对参环毛蚓提取总DNA,使用TaiL-PCR进行扩增,对扩增结果进行电泳分析,以获得符合预测的条带,测序。3结果3.1MT-2基因的RNA表达丰度分析通过诱导实验,成功地建立了参环毛蚓MT-2基因半定量RT-PCR实验体系,半定量RT-PCR实验结果表明,参环毛蚓MT-2基因的RNA表达丰度与重金属Cd2+的诱导浓度呈正相关。3.2MT-2基因的T-A克隆通过蓝白斑筛选以及电泳检验,成功构建了MT-2的克隆载体,测序结果显示,参环毛蚓MT-2基因序列共237个碱基,编码78个氨基酸。3.3MT-2的原核表达质粒的构建通过菌液PCR、双酶切以及测序验证,成功构建了参环毛蚓PET-32a(+)-MT-2原核表达载体,预期表达25KDa的融合蛋白。3.4MT-2融合蛋白的表达通过对不同诱导时间、浓度、温度的摸索,获得了诱导表达的最佳条件,成功表达出大小为25KDa的融合蛋白。该融合蛋白同时存在诱导菌液的上清和沉淀中,其中多为可溶性蛋白。融蛋白在活性测试中表现出一定的蛋白质原活性。3.5Tail-PCR成功建立了参环毛蚓Tail-PCR实验体系,在对MT-2上游序列的扩增中成功获得单一明亮的条带,但鉴于该实验PCR的特殊性,无法成功进行测序,拟对样品进行克隆以获得完整序列。4结论本研究通过半定量RT-PCR实验成功验证了MT-2与重金属诱导的相关性,同时构建了参环毛蚓MT-2克隆与表达载体,并成功表达出具备蛋白活性的MT-2融合蛋白,在TaiL-PCR实验中成功扩增出符合大小预期的条带。然而,Tail-PCR扩增产物没有能够成功测序,究其原因可能有二,一是Tail-PCR在扩增过程中一直采用长短差异较大的引物,其退火温度相差较大,造成测序时引物在常规测序程序下不能成功与样品结合,造成测序失败；二是Tail-PCR所获得的条带在同一大小可能有多个条带,样品不纯而导致失败。对于前一种问题,可以通过T-A克隆后进行测序得到解决,后一种则只能通过更多的PCR筛选得到更纯的条带。