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背景及目的:糖尿病性膀胱病(Diabetic cystopathy,DCP)晚期主要表现为失代偿性的膀胱兴奋性下降和逼尿肌收缩无力,导致排尿困难、残余尿增加、慢性尿潴留及充溢性尿失禁等临床症状,现有理论认为发生机制可能包括:支配膀胱的相关神经损害,膀胱逼尿肌功能受损,膀胱泌尿上皮功能改变,膀胱间质内胶原纤维比例降低和弹力纤维合成增加和尿道协调失衡等。而现在越来越来的研究证实,晚期逼尿肌细胞的功能异常和数量减少是导致膀胱收缩无力进而出现一系列相应症状的最直接原因。本课题拟深入研究和阐明逼尿肌细胞在DCP晚期逼尿肌无力发生中的病理基础和分子机制,并初步观察尿源性干细胞的修复治疗效果。方法:第一部分:研究ICC细胞兴奋异常在DCP逼尿肌无力中的作用我们通过腹腔注射链脲佐菌素加高脂高糖饮食建立大鼠糖尿病模型,将大鼠分为两组:1.正常大鼠:NC;2.DCP大鼠:DCP。通过胰岛素抵抗实验、膀胱测压和纤维化分析鉴定模型建模成功;通过q RT-PCR、western blot和免疫荧光染色分析HCN通道核酸和蛋白表达分布差异;原代分离培养膀胱ICC细胞后,通过膜片钳检测HCN介导的Ih电流大小和通道活性差异;通过离体肌条张力测定和细胞内钙离子浓度测定比较HCN通道对膀胱收缩力和钙离子活动的作用差异;透射电镜分析ICC细胞数量和其上小窝结构的表达差异,Western blot检测小窝蛋白表达变化;免疫荧光染色和免疫共沉淀共定位小窝蛋白3和HCN通道蛋白,证明两者间相互作用;使用si RNA转染原代ICC细胞下调Caveolin-3表达水平,观察比较Caveolin-3对HCN通道表达和通道功能活性的影响。第二部分:探讨AGEs介导DCP逼尿肌细胞凋亡的作用机制收集DCP患者膀胱样本,检测AGEs和RAGE的表达差异。再通过第一部分建模方法建立DCP大鼠模型,SD大鼠分为四组:正常大鼠:NC;DCP大鼠:DCP;DCP大鼠腹腔注射ALT-711治疗:DCP+ALT-711;DCP大鼠口服AG治疗:DCP+AG。通过检测以下内容指标,观察DCP大鼠的疾病状态特点和ALT-711、AG的治疗效果:免疫组化和Elisa实验检测血清、胰腺内胰岛素含量和膀胱内AGEs的含量;绘制大鼠体重和空腹血糖变化曲线;膀胱测压和离体肌条张力测定检测膀胱排尿和收缩力变化;Western blot检测RAGE、氧化应激和细胞凋亡关键调控蛋白SOD-2、Caspase-3的表达差异,观察和细胞凋亡密切的MAPK信号通路相关蛋白表达差异;TUNEL染色和Masson染色检测大鼠膀胱组织细胞凋亡和纤维化改变;原代分离培养膀胱逼尿肌细胞,通过外源性AGEs-BSA培养处理后,观察其对细胞内活性氧ROS的浓度影响,探讨时间和浓度依赖特性,检测相关蛋白RAGE和SOD-2的表达变化;通过转染si RNA-RAGE和si RNA-p38-MAPK后下调目的基因表达水平,检测细胞内活性氧浓度变化和细胞凋亡百分比,证实该信号通路在AGEs诱导细胞氧化应激和细胞凋亡中的作用。第三部分:初步观察尿源性干细胞对DCP逼尿肌无力大鼠模型的治疗作用原代分离培养人尿源性干细胞,初步观察其增值和转分化特性。将分离培养的人尿源性干细胞转染携带e GFP的慢病毒进行标记,通过尾静脉注射进入DCP大鼠体内,观察人尿源性干细胞在体内重要器官的归巢情况和治疗效果,实验分组为:正常大鼠:NC;DCP大鼠:DCP;DCP大鼠注射人尿源性干细胞治疗:DCP+USCs。观察了大鼠血糖、体重、膀胱湿重、血生化指标、大鼠糖代谢情况变化;膀胱测压和离体肌条收缩实验观察膀胱排尿功能和收缩力恢复情况;HE染色、Masson染色和TUNEL染色观察大鼠逼尿肌纤维化和细胞凋亡情况;Western blot蛋白定量:α-SMA,Caspase-3。结果:1.低剂量链脲佐菌素腹腔注射联合高脂高糖高蛋白饮食可较好的模拟2型糖尿病模型,注射12周后大鼠膀胱出现糖尿病性膀胱病逼尿肌无力的典型表现;DCP大鼠膀胱中HCN通道四个亚型的核酸和蛋白表达量降低,HCN介导的Ih电流密度下降;HCN通道蛋白位于小窝结构域内,小窝及其结构蛋白Caveolin-3在DCP时表达降低,该蛋白可与HCN通道的四个亚型发生相互作用并正向调控HCN通道介导的Ih电流。2.DCP患者膀胱组织中AGEs含量和RAGE表达均显著增加;口服氨基胍和腹腔注射阿拉氯胺治疗DCP大鼠后,两者均可在体阻断AGEs的产生,进而抑制细胞氧化应激和凋亡,改善DCP大鼠的排尿功能和肌条收缩力;AGEs可在体外呈时间和浓度依赖性地诱导逼尿肌细胞活性氧ROS和细胞凋亡,使用si RNA干扰RAGE和p38-MAPK的表达后,AGEs诱导的细胞内ROS增加和细胞凋亡比率明显受到抑制,相应的标志蛋白Caspase-3、SOD-2的表达也有所降低。3.成功在人尿液中分离提取了原代尿源性干细胞,并能有效增殖传代,使用PDGF5ng/ml+TGFβ2.5ng/ml、VEGF 30ng/ml分别培养尿源性干细胞14天后,部分干细胞分化成上皮细胞和平滑肌细胞。每隔一周进行尾静脉注射使用携带e GFP基因的尿源性干细胞后,干细胞可在胰腺归巢,但未能在膀胱中检测到归巢细胞。但注射干细胞后,DCP膀胱纤维化和逼尿肌细胞凋亡得到有效机制,DCP大鼠逼尿肌收缩力和排尿功能也有不同程度改善。结论:1.膀胱ICC细胞的数量减少和其HCN通道蛋白表达和功能活性降低可能是DCP逼尿肌无力发生的重要分子基础,小窝结构域内的Caveolin-3可与HCN通道的四个亚型发生相互作用并调控HCN通道的活性。2.AGEs在膀胱内过量堆积可激活RAGE/p38-MAPK信号通路诱导逼尿肌细胞氧化应激和细胞凋亡。3.原代分离人尿源性干细胞注射可抑制DCP膀胱纤维化和逼尿肌细胞凋亡,改善DCP大鼠逼尿肌收缩力和排尿功能。简而言之,DCP的机制复杂,难以阐明。可能涉及离子通道、神经受体和多种细胞病理过程的变化。同源尿源性干细胞可能是一种新的治疗资源。