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本实验通过运用离体培养的大鼠海马神经细胞,观察过氧化氢(H2O2)和谷氨酸(Glu)对海马神经细胞的损伤效应及GAL在海马神经细胞损伤过程中的保护作用,并初步探讨这种作用的产生机理。实验共分为三部分:
第一部分,选取新生大鼠分离双侧海马细胞进行培养,并通过阿糖胞苷(Ara-C)处理得到较纯的海马神经细胞。用免疫组化ABC法对海马神经细胞特性进行鉴定并检测GAL阳性神经细胞,用RT-PCR方法来检测GAL三种受体mRNA的表达。
第二部分,建立离体培养海马神经细胞的损伤模型。采用一系列浓度的过氧化氢和谷氨酸损伤海马神经细胞,通过MTT法检测细胞的存活率。
第三部分,GAL的保护作用。观察GAL,GAL的激动剂GAL1-11、GAL2-¨对损伤细胞的作用。用GAL非特异性拮抗剂M35观察其是否阻断GAL及其激动剂的作用,并用Fura-2标记细胞内游离钙的方法探讨GAL可能的受体作用机制及胞内信号传导途径。
实验结果:
1)经过上述分离与纯化细胞的方法,我们成功地获得能在体外稳定生长的海马神经细胞。体外培养的海马神经细胞表达GAL蛋白,并表达GAL受体GalR2和GalR3的mRNA,但不表达GalR1的mRNA。
2)H2O2浓度为0.2mM及以上剂量,Glu浓度为0.3mM以上剂量均能显著降低海马神经细胞的存活率,并且随着H2O2和Glu浓度的增加,细胞的存活率不断降低。
3)各个浓度的GAL、GAL1-11和GAL2-11均能显著提高海马神经细胞的存活率。GAL非特异性受体拮抗剂M35能够明显拮抗GAL、GAL1-11和GAL2-11对海马神经细胞的这种作用。另外,GAL能显著降低受损海马神经细胞内的游离钙离子浓度。
综上所述,从新生SD大鼠的海马分离纯化得到了较纯的海马神经细胞,利用这种细胞建立损伤模型,并研究GAL对细胞的保护作用。结果说明GAL能提高海马神经细胞在H2O2和Glu损伤中的存活率,并且这种作用能被其拮抗剂所阻断。此外,海马神经细胞表达受体GalR2和GalR3的mRNA,提示GAL可能是通过其受体起作用。受体GALR能通过与G蛋白偶联改变钙通道的活性,而钙积累是H2O2损伤和Glu损伤共同的机制之一,由此提示,GAL可能通过改变钙通道的活性而保护了神经元。本实验中GAL能降低H2O2损伤的海马神经细胞内的钙离子浓度也为上述推断提供了进一步的证据。