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肠道病毒71（Enterovirus71，EV71）属于小RNA科肠道病毒属，是一种由7400多个核苷酸组成的单正链RNA病毒[1]。EV71是引起儿童手足口病（Hand，foot andmouthdisease，HFMD）的主要病原体[2]。EV71感染可伴有一系列中枢神经系统疾病，如无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹及致死性脑炎[3,4]。自1969年以来，EV71已在全球引起12起大规模疫情爆发，亚洲地区最严重，死亡率最高[5]。 EV71的衣壳蛋白VP1是主要的中和抗原，具有作为亚单位疫苗的潜力[6,7]。而且，针对VP1蛋白的检测也可用于EV71感染的诊断[6-8]。因此，研发抗VP1的单抗对于EV71的预防和诊断具有重要科学意义和应用价值。 目的： 1.原核表达EV71的衣壳蛋白VP1 2.制备抗VP1的小鼠源性单克隆抗体并初步研究其应用潜力 方法： 1.肠道病毒71型VP1蛋白的原核表达： 我们从前期临床样本中分离出的 EV71病毒株中提取 RNA，采用 RT-PCR扩增VP1基因序列，并将其克隆入原核表达载体质粒pET21a中，构建重组质粒。然后将重组质粒转入大肠杆菌BL21株，采用SDS-PAGE和Western Blot（WB）检测重组蛋白VP1的表达情况。 2.VP1蛋白纯化及其免疫原性的研究： 采用亲合层析柱纯化重组的VP1蛋白。利用VP1蛋白免疫BALB/c小鼠后，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测免疫小鼠血清中特异性抗VP1抗体效价。基于EV71感染的Vero细胞，采用间接免疫荧光实验（IFA）评估VP1小鼠免疫血清识别EV71的情况。 3.抗VP1小鼠源性单克隆抗体的制备及其应用研究： 将VP1蛋白免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，基于HAT选择培养基通过有限稀释法获得单克隆细胞。采用ELISA和IFA实验筛选能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。将这些杂交瘤细胞株接种于小鼠腹腔内，制备含有单克隆抗体的腹水，并采用亲合层析柱纯化单克隆抗体 IgG。采用 ELISA和 IFA实验评估其用于检测EV71感染的能力。 结果： 1.成功构建重组质粒 pET21a-VP1，并且诱导表达了VP1蛋白，其分子量大小约为37 KD，并用SDS-PAGE电泳和WB验证了其表达。 2.VP1蛋白免疫小鼠展示了其具有良好的免疫原性，ELISA实验结果显示VP1小鼠免疫血清内存在高水平抗VP1的抗体。IFA结果也表明抗VP1的抗体能识别EV71的相应成分。 3.获得4株能稳定分泌特异性抗VP1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，IFA结果表明其所纯化的抗VP1的单克隆抗体可用于EV71感染的检测。 结论： 原核表达的EV71-VP1具免疫原性，所获得的小鼠源性抗EV71-VP1的单克隆抗体可识别EV71。