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[目的]通过体外实验研究重组腺病毒KGHV500对脑胶质瘤U251细胞生物活性等的影响,通过体内实验研究CIK携带重组腺病毒KGHV500共同介导抗p21Ras单链抗体治疗裸鼠脑胶质瘤移植瘤的效果及靶向性,实现抗p21Ras单链抗体在脑胶质瘤中的持续长效表达,为治疗脑胶质瘤提供实验依据及新方法。[方法]一、重组腺病毒KGHV500和KGHV400的扩增、浓缩、纯化、鉴定:体外利用HEK293细胞将重组腺病毒KGHV500大量扩增;经PCR鉴定其是否含有纤毛片段和单链抗体片段;经双重氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒,利用TCID50法测其滴度;KGHV500以不同MOI值感染人脑胶质瘤U251细胞,以确定KGHV500感染人脑胶质瘤U251细胞的最佳感染复数。二、体外实验:免疫组织化学检测人脑胶质瘤U251细胞表面CD46蛋白的表达情况;透射电镜观察重组腺病毒KGHV500、KGHV400对人脑胶质瘤U251细胞的感染情况;细胞划痕实验检测KGHV500对人脑胶质瘤U251细胞迁移能力的影响;MTT比色实验检测KGHV500对人脑胶质瘤U251细胞活力的影响;Transwell侵袭小室实验检测KGHV500对人脑胶质瘤U251细胞侵袭能力的影响;TUNEL凋亡实验检测KGHV500对人脑胶质瘤U251细胞的促凋亡作用。三、CIK细胞的分离制备、培养与鉴定:分离人外周血单个核细胞,采用多种细胞因子共培养诱导成为CIK细胞;利用免疫组织化学Envision法对CIK细胞表面CD3、CD56蛋白检测以鉴定CIK细胞;利用免疫组织化学Envision法对CIK细胞表面的KGHV500受体CD46蛋白进行鉴定;免疫组织化学Envision法检测KGHV500对CIK细胞的感染效率;电镜观察CIK细胞携带重组腺病毒KGHV500、KGHV400的情况。四、建立人脑胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤模型并分组尾静脉进行注射治疗以及体内实验:裸鼠右侧腋下皮下注射人脑胶质瘤U251细胞建立裸鼠脑胶质瘤移植瘤模型,将成瘤裸鼠随机分组治疗,实验组尾静脉注射携带KGHV500的CIK细胞,四个对照组分别尾静脉注射携带KGHV400的CIK细胞、KGHV500、CIK细胞、PBS缓冲液以进行治疗。动态监测各组裸鼠生长状态及移植瘤大小,绘制肿瘤生长曲线;观察各分组治疗脑胶质瘤移植瘤的效果,取实验组尾静脉注射KGHV500+CIK和对照组尾静脉注射KGHV500的裸鼠进行比较,在治疗后第1、3、5、7天分别处死两组裸鼠各一只,剖取肿瘤及心、肝、脾、肺、肾、胃、胰、大肠、小肠、脑组织制成石蜡标本并切片进行HE染色,观察肿瘤和各脏器的病理变化,,并利用免疫组织化学Envision法观察重组腺病毒及其表达的单链抗体在裸鼠移植瘤内的表达情况,免疫组织化学Envision法观察重组腺病毒六邻体在裸鼠各脏器组织中的表达情况;Western Blot检测实验组尾静脉注射KGHV500+CIK和对照组尾静脉注射KGHV500组的裸鼠在治疗后期,两组裸鼠的移植瘤组织及各脏器组织中的单链抗体的表达情况;TUNEL凋亡实验检测各组治疗后期的移植瘤组织中的细胞凋亡情况;RT-qPCR检测各组治疗后期的移植瘤组织中的凋亡基因表达。[结果]一、采用特异性引物对重组腺病毒KGHV500进行PCR扩增后,经电泳检测显示重组腺病毒含有ScFv片段、F5/35片段,鉴定确为重组腺病毒KGHV500,双重氯化铯密度梯度离心并透析纯化后,最终获得的重组腺病毒KGHV500、KGHV400 的滴度分别为 1×109pfu/ml、1.5×1010pfu/ml,KGHV500感染人脑胶质瘤U251细胞最佳感染复数MOI为100。二、体外实验:(1)免疫组织化学Envision法检测人脑胶质瘤U251细胞表面的KGHV500受体CD46蛋白的阳性表达率约100%,且定位于细胞膜;(2)透射电镜观察重组腺病毒KGHV500、KGHV400感染脑胶质瘤U251细胞后进入细胞,病毒颗粒可见于U251细胞胞浆内;(3)细胞划痕实验显示KGHV500能抑制人脑胶质瘤U251细胞的迁移能力,实验组KGHV500感染的U251细胞在24小时、36小时的细胞迁移率分别为(12.28±2.51)%、(26.25±2.48)%;KGHV400 感染的 U251细胞对照组在24小时、36小时的细胞迁移率分别为(27.27±3.24)%、(43.32±1.7)%;未感染重组腺病毒的U251细胞在24小时、36小时的细胞迁移率分别为(39.54±1.38)%、(89.48±0.24)%;(4)MTT比色实验结果显示实验组KGHV500感染的U251细胞在第1、2、3、4、5天时的吸光度分别为0.56±0.026、0.24±0.021、0.16±0.029、0.11±0.032、0.06±0.033。对照组 KGHV400感染的U251细胞在第1、2、3、4、5天时的吸光度分别为0.58±0.033、0.57±0.05、0.60±0.078、0.84±0.023、0.99±0.057。未感染重组腺病毒的 U251 细胞在第 1、2、3、4、5 天时的吸光度分别为 0.59±0.025、0.67±0.038、0.81±0.06、1.15±0.083、1.37±0.18,结果显示KGHV500能够明显抑制人脑胶质瘤U251细胞的活力;(5)Transwell侵袭小室实验显示KGHV500能明显抑制人脑胶质瘤U251细胞的侵袭能力,感染20小时后,实验组KGHV500感染的U251细胞侵袭至微孔膜下层的细胞数为1.75±1.03;对照组KGHV400感染的U251细胞侵袭至微孔膜下层的细胞数为16.83±2.54,对照组未感染重组腺病毒的U251细胞在20小时后侵袭至微孔膜下层的细胞数为144.50±29.12;(6)TUNEL凋亡实验显示实验组KGHV500感染脑胶质瘤U251细胞后,细胞凋亡率为(73.10±3.14)%;对照组KGHV400感染脑胶质瘤U251细胞后,细胞凋亡率为(18.46±2.32)%;对照组未感染重组腺病毒的脑胶质瘤U251细胞凋亡率为(1.44±0.03)%,结果表明KGHV500对人脑胶质瘤U251细胞有明显的促凋亡作用。三、分离人外周血单个核细胞:经多种细胞因子共培养诱导成CIK细胞;CIK细胞经免疫组织化学鉴定,其表面CD3、CD56蛋白的双阳性率约30%,鉴定其确为CIK细胞,CIK细胞表面CD46阳性率约100%,且阳性定位于CIK细胞膜;免疫组化Envision法检测KGHV500对CIK细胞的感染效率约为90%;透射电镜观察感染了重组腺病毒KGHV500、KGHV400的CIK细胞,可见CIK细胞膜表面黏附有腺病毒颗粒。四、(1)建立人脑胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤模型;(2)分组尾静脉进行注射治疗:实验组尾静脉注射KGHV500+CIK,对照组分别尾静脉注射KGHV400+CIK细胞、KGHV500、CIK细胞、PBS缓冲液;(3)动态监测各组裸鼠生长状态及移植瘤大小,肿瘤生长曲线显示在尾静脉注射治疗后的第34天,上述五组的移植瘤体积(mm3)分别达到350.30±93.30、1111.80± 145.23、1650.00±241.91、2325.30±332.04、3222.60±407.27,实验组移植瘤组织生长缓慢,而对照组移植瘤组织生长较快;(4)HE可见实验组与对照组移植瘤组织无明显形态学差异;(5)实验组尾静脉注射KGHV500+CIK和对照组尾静脉注射KGHV500的裸鼠在治疗后第1、3、5、7天分别处死的裸鼠的移植瘤组织腺病毒六邻体和单链抗体的表达随着时间而逐渐表达增强,实验组的阳性强于对照组;(6)实验组裸鼠在脾脏、肾脏、肝脏中检测到不同程度的腺病毒及单链抗体阳性表达,心脏、肺、胃、胰腺、大肠、小肠和脑组织中未发现腺病毒阳性表达;而对照组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃、胰、大肠、小肠的腺病毒六邻体表达均可检测到阳性表达;(7)Western Blot检测实验组尾静脉注射KGHV500+CIK和对照组尾静脉注射KGHV500组裸鼠的移植瘤组织及各脏器组织中的单链抗体的表达情况,结果显示:实验组中移植瘤组织中有较强的抗p21Ras单链抗体表达,其中脾脏、肝脏和肾脏也有一定量的单链抗体表达,心脏、肺、胃、胰脏、脑、大肠、小肠中没有单链抗体的表达。对照组中除脑组织外,皆有单链抗体表达;(8)TUNEL凋亡实验显示实验组尾静脉注射KGHV500+CIK、对照组分别尾静脉注射KGHV400+CIK、重组腺病毒KGHV500、CIK细胞、PBS缓冲液,各组的细胞凋亡率分别为(78.20±3.52)%、(27.23±3.21)%、(20.47±1.04)%、(8.83±0.78)%、(2.10±0.99)%;(9)RT-qPCR检测各组治疗后期的移植瘤组织中的的凋亡基因表达,实验组中促凋亡基因Caspase-3、Caspase-7、p53均表达量较高,而抗凋亡基因Bcl-2、Survivin的表达较低,显示CIK细胞携带KGHV500可明显促进裸鼠移植瘤的凋亡。[结论]体外实验结果表明肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV500可明显抑制U251脑胶质瘤的迁移、侵袭能力并抑制脑胶质瘤细胞的活力,且促进脑胶质瘤细胞凋亡。体内实验中,肿瘤生长曲线显示CIK携带KGHV500对脑胶质瘤移植瘤有明显的生长抑制作用;且CIK细胞携带KGHV500可有效地靶向移植瘤组织。体内和体外实验证实CIK细胞和KGHV500共同介导抗p21ras单链抗体治疗脑胶质瘤移植瘤的有效性和较好的靶向性。