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乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)是酒精代谢的两大关键酶,以NAD+或NADP+作为辅酶,将酒精催化氧化成乙酸。东亚人群在乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因上存在缺陷,对酒精代谢能力差,饮酒后极易发生醉酒并更进一步引发各种酒精性疾病,因此外源的补充ADH及ALDH,在消化道内代谢酒精,具有重大研究意义及应用前景。但是ADH及ALDH对酸性环境不耐受性以及大肠杆菌表达系统的安全隐患,制约了大肠杆菌表达ADH及ALDH在人体酒精降解的应用。与大肠杆菌表达系统比较,运用乳酸菌表达系统进行外源蛋白表达具有食品级、乳酸菌益生作用以及耐受消化道极端环境的优势。然而,国内外未见有报道利用乳酸菌表达系统进行ADH及ALDH表达研究,因此利用乳酸菌系统共表达ADH和ALDH,并以全细胞催化的方式在消化道内进行酒精催化氧化,具有重要的研究价值。以前期对陆生伊萨酵母乙醛脱氢酶(IstALDH)克隆表达研究为基础,本研究在食品级乳酸乳球菌NZ3900中活性表达该乙醛脱氢酶,研究低pH条件对全细胞催化乙醛降解活性的影响;进一步探索该酶与酿酒酵母来源乙醇脱氢酶(ScADH)的共表达策略,构建ScADH与IstALDH共表达活性乳酸菌;制备活性乳酸菌冻干粉,探讨其在小鼠急性酒精性肝损伤中的保护作用;探究surfactin及其免疫相关swrC基因作为替换抗生素筛选的新型乳酸菌食品级筛选标记的应用潜力,构建基于swrC基因筛选的IstALDH表达载体。研究结果分述如下:1、IstALDH在NZ3900表达及活性乳酸菌全细胞催化乙醛降解构建重组乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8148-istALDH,优化nisin诱导条件,在20℃下以50 ng/mL浓度nisin诱导2h,乙醛脱氢酶活力为36.4 U/mL,结果表明在乳酸乳球菌NZ3900成功活性表达IstALDH。研究温度及pH值对IstALDH活性乳酸菌的影响,结果表明活性乳酸菌最适反应pH值为9.0,且在pH 3.0-5.0,有15%的活力剩余;活性乳酸菌最适反应温度45℃,且在25℃和30℃具有良好的温度稳定性,60 min内酶活力无变化。通过气相色谱法研究活性乳酸菌全细胞催化乙醛降解,结果表明在pH 2.0条件下,IstALDH活性乳酸菌60 min内乙醛降解速率为2.89±0.22μmol/h,并且在90 min内保持有催化活力,证明IstALDH活性乳酸菌具有良好低pH耐受性,在酸性环境下具有催化乙醛降解活性。2、ScADH在NZ3900表达及分离纯化构建重组乙醇脱氢酶表达菌株NZ3900/PNZ8148-scADH,经nisin诱导,乙醇脱氢酶活力为75.09 U/mL,结果表明在乳酸乳球菌NZ3900成功活性表达ScADH。应用Blue Sepharose 6FF亲和层析和QFF离子交换层析两步纯化法纯化ScADH,获得电泳纯酶,总纯化倍数19.2,回收率14.3%。对乙醇脱氢酶性质研究表明,该酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为8.5,在pH 6.0-9.0及25-37℃具有良好的稳定性,证明酿酒酵母来源的乙醇脱氢酶与陆生伊萨酵母来源乙醛脱氢酶性质相似,适合作为共表达联用酶。3、ScADH 与 IstALDH 在 NZ3900 中共表达以融合表达、双顺反子共表达以及双启动子共表达三种策略进行乳酸乳球菌异源共表达ScADH及IstALDH研究,以双启动子策略成功构建共表达菌株NZ3900/pNZ8148-GBD,经 nisin诱导 ScADH 酶活为 6.6 U/mL,IstALDH 酶活为 1.4 U/mL,结果表明在乳酸乳球菌中成功活性共表达ScADH与IstALDH。对活性ScADH与IstALDH共表达乳酸乳球菌冻干条件进行研究,结果表明以10%脱脂乳、4%甘油及4%谷氨酸钠作为冻干保护剂,以10s CFU/mL菌体浓度于液氮速冻并转移-80℃预冻16 h,再进行真空冷冻干燥,具有90.8%的菌体存活率、82.4%乙醇脱氢酶活力保留及81.3%的乙醛脱氢酶活力保留。4、活性乳酸菌冻干粉对小鼠急性酒精性肝损伤保护作用构建酒精性肝损伤小鼠模型,对模型小鼠进行连续大剂量酒精灌胃处理(15 d,5.6 g/kg/d BW),与对照组小鼠相比,其ALT、AST及AKP活力显著升高了 93.0%、200.0%及36.1%,血脂指标、肝组织抗氧化指标异常,结果表明急性酒精性肝损伤小鼠模型构建成功。并通过灌胃不同酶活力的活性乳酸菌冻干粉,探究其对小鼠急性酒精性肝损伤的作用,结果表明高酶活力活性乳酸菌冻干粉(ScADH 2000 U/kg BW,IstALDH 1000 U/kg BW)混合灌胃处理,显著降低酒精组小鼠ALT活力38.1%,AST活力54.8%,AKP活力23.2%,并且高活力乳酸菌冻干粉处理组小鼠与对照组相比,血脂指标、肝组织抗氧化指标差异不显著,肝细胞形态接近,cyp2e1、mcp1、tlr4及tlr5基因表达维持正常水平,研究证明高酶活力共表达活性乳酸菌冻干粉对小鼠急性酒精性肝损伤具有显著保护作用。5、基于surfactin抗性筛选的乙醛脱氢酶乳酸菌表达载体构建从枯草芽胞杆菌基因组克隆surfactin免疫相关swrC基因,并利用pMG36e载体在乳酸乳球菌NZ3900中表达,结果表明swrC基因的表达增强NZ3900对surfactin的免疫能力,并且surfactin筛选压力为100 μg/mL。以PpepN启动子替换pMG36e的P32启动子,构建植物乳杆菌LP163表达载体pFMB4191,在LP163中表达swrC基因,结果表明swrC基因编码的蛋白也增强LP163对surfactin的免疫能力,证明surfactin及swrC基因能作为乳酸菌广宿主筛选标记。构建具有红霉素和surfactin双筛选压力的乙醛脱氢酶表达载体PFMB4197,在NZ3900中验证质粒稳定性及酶活力表达,结果表明在100 μg/mL的surfactin压力下,培养18 h,有95%的质粒传代稳定性,最终培养物检测到2.6 U/mL乙醛脱氢酶活力。