肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，每年都有超过一百万新发病例，其中约80%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）。作为一种全身性疾病，肺癌发生、发展、转移及复发是由多条信号转导通路调节，多因素参与的复杂过程。对肿瘤信号转导通路的研究有助于阐明NSCLC的发病机制，为NSCLC的治疗提供新的分子靶点。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）为具有酪氨酸激酶活性的受体，分子量170kD（a1186氨基酸），位于染色体7q12。EGFR家族有4个结构相似的受体分子：ErbB1（EGFR）、ErbB2（HER2）、ErbB3（HER3）、ErbB4（HER4）。EGFR为跨膜受体，有细胞外的配体结合区域，跨膜区和细胞内的酪氨酸激酶活性区域组成。EGFR具有酪氨酸激酶活性，通过与配体结合，EGFR形成同源或异源二聚体而活化，进一步激活受体介导的多条信号转导通路，如Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt通路等，发挥促进肿瘤增殖、侵袭、转移及肿瘤血管生成作用。EGFR由表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）激活，调节正常和恶性上皮细胞的生长、分化和存活。EGFR在40-80%的NSCLC过表达中表达，而且其表达与预后不佳相关。因此，EGFR和它的家族成员已成为靶向治疗的主要候选靶分子。NSCLC患者EGFR过表达，往往提示TNM分期晚，出现淋巴结转移的可能性大，进展快，预后不良。细丝蛋白A（filamin A，FLNa）是非肌性肌动蛋白结合蛋白，基因结构高度保守，表达广泛，对哺乳动物的生长发育具有重要的作用。FLNa蛋白包括一个肌动蛋白结合结构域和24个串联的重复序列，研究发现FLNa重复序列所形成的类似免疫球蛋白样结构的多重β-折叠片层结构，为蛋白质-蛋白质相互作用提供了界面。FLNa涉及多条与肿瘤形成有关的信号转导通路，如MAPK/ERK、PI3K/Akt、TGF-β等，影响肿瘤细胞的增殖、粘附、迁移和侵袭等行为。许多研究表明，FLNa在人类上皮肿瘤例如肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、结直肠癌等多种肿瘤表达增多。Zhu认为FLNa对于人黑色素瘤细胞EGFR的活化具有调控作用。FLNa是否调控肺腺癌细胞EGFR的活化目前尚无报道。本研究拟通过：（1）Western blot检测不同肺腺癌细胞中FLNa、EGFR蛋白的表达情况；（2）采用MTT法检测5种不同肺腺癌细胞的增殖能力；（3）质粒转染技术沉默FLNa的表达，构建稳定转染细胞，采用MTT法、划痕修复实验（Wound healing assay）及Transwell法（Transwell cellinvasion assay）检测稳定转染细胞的增殖、迁移和侵袭能力；（4）利用western blot、免疫共沉淀法（Immunoprecipitation，IP)检测EGFR磷酸化水平及其下游信号通路分子的变化。旨在从细胞、分子水平上分析FLNa对肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，探讨FLNa调控EGFR磷酸化及其下游信号分子的作用机制，为更有效治疗肺腺癌提供新靶点。目的：观察不同肺腺癌细胞FLNa和EGFR的表达情况，分析FLNa、EGFR与肺腺癌细胞增殖的关系；将pSIF1-FLNa siRNA质粒转染GLC-82细胞，降低FLNa的表达水平，观察FLNa对GLC-82细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响；探讨FLNa调控EGFR磷酸化及其下游信号分子的作用机制。方法：1Western blot检测不同肺腺癌细胞中FLNa、EGFR蛋白的表达情况；2采用MTT法检测不同肺腺癌细胞的增殖能力；3质粒转染技术沉默FLNa的表达，构建稳定低表达FLNa细胞，采用MTT法、Wound healing assay及Transwell法，检测稳定转染细胞的增殖、迁移和侵袭能力；4Western blot、IP检测EGFR酪氨酸磷酸化水平及其下游信号通路分子的变化。结果：1不同肺腺癌细胞的蛋白表达情况和增殖能力1.1不同肺腺癌细胞的蛋白表达情况应用ImageJ软件对蛋白条带进行扫描，SPSS13.0进行分析，不同肺腺癌细胞FLNa、EGFR的表达水平分别为：GLC-82(1.02±0.18，0.86±0.01)，H1975（1.15±0.05，0.92±0.01），A549（0.64±0.03，0.95±0.01），H1650（0.22±0.01，0.69±0.01）和H1299（0.79±0.02，1.13±0.01）。H1650细胞FLNa和EGFR的表达水平均低于其余各种细胞，均具有统计学意义（P<0.01）。1.2不同肺腺癌细胞的增殖情况利用MTT比色分析法测定各孔的OD值，分别于EGF刺激20h、44h后检测各孔的OD值，EGF刺激20h、44h后各种细胞OD值分别为：GLC-82（0.42±0.01，0.64±0.09），H1975（0.40±0.03，0.54±0.06），A549（0.30±0.02，0.65±0.06），H1650（0.12±0.01，0.20±0.03）和H1299（0.40±0.02，0.91±0.00），低表达FLNa的H1650细胞的OD值各时间点均明显低于其余各种细胞，均有统计学意义（P<0.01）。2实时定量PCR、western blot验证沉默FLNa效果2.1实时定量PCR检测稳定转染细胞的FLNa mRNA水平利用实时定量PCR检测GLC-82稳定细胞FLNa mRNA的水平，稳定转染FLNa siRNA的GLC-82细胞FLNa mRNA的相对定量值（0.38±0.23）明显低于对照组细胞（1.00），有统计学意义（P<0.05）。2.2Western blot检测稳定转染细胞FLNa的表达水平Western blot检测GLC-82稳定转染细胞FLNa的蛋白水平，稳定转染FLNa siRNA的GLC-82细胞FLNa的相对表达量（0.39±0.00），明显低于对照细胞（0.66±0.00），有统计学意义（P<0.05）。3GLC-82稳定转染细胞的增殖、迁移和侵袭情况3.1GLC-82稳定转染细胞的增殖情况将GLC-82稳定转染细胞接种于96孔板，MTT法检测各孔的OD值进行统计分析，分别经0nM、4nM、20nM EGF刺激后各孔的OD值，GLC-82/FLNa siRNA组(0.48±0.02，0.64±0.03，0.70±0.04)各浓度均明显低于对照组(0.55±0.04，0.73±0.05，0.81±0.04)，均有统计学意义（P<0.05）。3.2GLC-82稳定转染细胞的迁移情况利用相应软件测量划痕宽度，计算细胞迁移率：细胞迁移率=（划痕初始宽度-划痕目前宽度）/2/划痕初始宽度×100%。无EGF刺激时，降低FLNa表达的GLC-82细胞分别于8h、16h、24h和32h的迁移率（8.11±2.45%，15.78±0.84%，16.23±2.27%，19.89±2.91%）各时间点均低于对照组（15.47±0.74%，21.38±1.66%，25.00±2.17%，30.43±0.11%），均具有统计学意义（P<0.05）；GLC-82/FLNa siRNA细胞给予20nM EGF刺激后，各时间点的迁移率明显高于无EGF刺激组；GLC-82/Control细胞给予20nM EGF刺激后，从24h开始细胞迁移率明显高于无EGF刺激组，均有统计学意义（P<0.05）。3.3GLC-82稳定转染细胞的侵袭情况采用Transwell法检测细胞的侵袭能力，GLC-82/FLNa siRNA组穿膜细胞数(192±70)明显低于对照组(368±73)，有统计学意义（P<0.05）。4FLNa作用机制的探讨4.1沉默FLNa表达对GLC-82细胞EGFR活化的影响培养GLC-82稳定转染细胞，Western blot检测EGF刺激0min、5min、10min、30min后蛋白的表达情况。统计结果显示，FLNa siRNA组各时间点FLNa的表达量（0.10±0.00，0.28±0.00，0.25±0.00，0.18±0.00）均明显低于对照组（0.52±0.00，0.72±0.00，0.71±0.00，0.73±0.04），均有统计学意义（P<0.01）；FLNa siRNA组磷酸化EGFR分别于EGF刺激5min、10min、30min后的表达水平（0.74±0.00，0.53±0.00，0.23±0.00）均明显低于对照组（0.81±0.00，0.68±0.00，0.60±0.02），均有统计学意义（P<0.01）；FLNa siRNA组磷酸化ERK分别于EGF刺激5min、10min、30min后的表达水平（0.32±0.00，0.40±0.00，0.31±0.00）均明显低于对照组（0.38±0.01，0.63±0.00，0.98±0.01），均有统计学意义（P<0.01）。4.2IP证实FLNa对EGFR活化的影响经抗EGFR抗体免疫沉淀后，用抗酪氨酸磷酸化的抗体4G10进行印迹，观察EGFR磷酸化水平: EGF刺激5min后，FLNa siRNA组EGFR相对磷酸化水平（0.95±0.03）明显低于对照组（1.16±0.01），有统计学意义（P<0.01）。结论：1肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力与FLNa的表达水平密切相关，降低FLNa的表达水平可减弱肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，表明FLNa对肺腺癌细胞的增殖、转移具有促进作用。2肺腺癌细胞EGFR的磷酸化水平是影响肺癌发展的关键；FLNa通过影响肺腺癌细胞EGFR的磷酸化水平，调控Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路，进而影响肺腺癌细胞的增殖和转移。