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肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,每年都有超过一百万新发病例,其中约80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。作为一种全身性疾病,肺癌发生、发展、转移及复发是由多条信号转导通路调节,多因素参与的复杂过程。对肿瘤信号转导通路的研究有助于阐明NSCLC的发病机制,为NSCLC的治疗提供新的分子靶点。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)为具有酪氨酸激酶活性的受体,分子量170kD(a1186氨基酸),位于染色体7q12。EGFR家族有4个结构相似的受体分子:ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER2)、ErbB3(HER3)、ErbB4(HER4)。EGFR为跨膜受体,有细胞外的配体结合区域,跨膜区和细胞内的酪氨酸激酶活性区域组成。EGFR具有酪氨酸激酶活性,通过与配体结合,EGFR形成同源或异源二聚体而活化,进一步激活受体介导的多条信号转导通路,如Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt通路等,发挥促进肿瘤增殖、侵袭、转移及肿瘤血管生成作用。EGFR由表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)激活,调节正常和恶性上皮细胞的生长、分化和存活。EGFR在40-80%的NSCLC过表达中表达,而且其表达与预后不佳相关。因此,EGFR和它的家族成员已成为靶向治疗的主要候选靶分子。NSCLC患者EGFR过表达,往往提示TNM分期晚,出现淋巴结转移的可能性大,进展快,预后不良。细丝蛋白A(filamin A,FLNa)是非肌性肌动蛋白结合蛋白,基因结构高度保守,表达广泛,对哺乳动物的生长发育具有重要的作用。FLNa蛋白包括一个肌动蛋白结合结构域和24个串联的重复序列,研究发现FLNa重复序列所形成的类似免疫球蛋白样结构的多重β-折叠片层结构,为蛋白质-蛋白质相互作用提供了界面。FLNa涉及多条与肿瘤形成有关的信号转导通路,如MAPK/ERK、PI3K/Akt、TGF-β等,影响肿瘤细胞的增殖、粘附、迁移和侵袭等行为。许多研究表明,FLNa在人类上皮肿瘤例如肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、结直肠癌等多种肿瘤表达增多。Zhu认为FLNa对于人黑色素瘤细胞EGFR的活化具有调控作用。FLNa是否调控肺腺癌细胞EGFR的活化目前尚无报道。本研究拟通过:(1)Western blot检测不同肺腺癌细胞中FLNa、EGFR蛋白的表达情况;(2)采用MTT法检测5种不同肺腺癌细胞的增殖能力;(3)质粒转染技术沉默FLNa的表达,构建稳定转染细胞,采用MTT法、划痕修复实验(Wound healing assay)及Transwell法(Transwell cellinvasion assay)检测稳定转染细胞的增殖、迁移和侵袭能力;(4)利用western blot、免疫共沉淀法(Immunoprecipitation,IP)检测EGFR磷酸化水平及其下游信号通路分子的变化。旨在从细胞、分子水平上分析FLNa对肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,探讨FLNa调控EGFR磷酸化及其下游信号分子的作用机制,为更有效治疗肺腺癌提供新靶点。目的:观察不同肺腺癌细胞FLNa和EGFR的表达情况,分析FLNa、EGFR与肺腺癌细胞增殖的关系;将pSIF1-FLNa siRNA质粒转染GLC-82细胞,降低FLNa的表达水平,观察FLNa对GLC-82细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;探讨FLNa调控EGFR磷酸化及其下游信号分子的作用机制。方法:1Western blot检测不同肺腺癌细胞中FLNa、EGFR蛋白的表达情况;2采用MTT法检测不同肺腺癌细胞的增殖能力;3质粒转染技术沉默FLNa的表达,构建稳定低表达FLNa细胞,采用MTT法、Wound healing assay及Transwell法,检测稳定转染细胞的增殖、迁移和侵袭能力;4Western blot、IP检测EGFR酪氨酸磷酸化水平及其下游信号通路分子的变化。结果:1不同肺腺癌细胞的蛋白表达情况和增殖能力1.1不同肺腺癌细胞的蛋白表达情况应用ImageJ软件对蛋白条带进行扫描,SPSS13.0进行分析,不同肺腺癌细胞FLNa、EGFR的表达水平分别为:GLC-82(1.02±0.18,0.86±0.01),H1975(1.15±0.05,0.92±0.01),A549(0.64±0.03,0.95±0.01),H1650(0.22±0.01,0.69±0.01)和H1299(0.79±0.02,1.13±0.01)。H1650细胞FLNa和EGFR的表达水平均低于其余各种细胞,均具有统计学意义(P<0.01)。1.2不同肺腺癌细胞的增殖情况利用MTT比色分析法测定各孔的OD值,分别于EGF刺激20h、44h后检测各孔的OD值,EGF刺激20h、44h后各种细胞OD值分别为:GLC-82(0.42±0.01,0.64±0.09),H1975(0.40±0.03,0.54±0.06),A549(0.30±0.02,0.65±0.06),H1650(0.12±0.01,0.20±0.03)和H1299(0.40±0.02,0.91±0.00),低表达FLNa的H1650细胞的OD值各时间点均明显低于其余各种细胞,均有统计学意义(P<0.01)。2实时定量PCR、western blot验证沉默FLNa效果2.1实时定量PCR检测稳定转染细胞的FLNa mRNA水平利用实时定量PCR检测GLC-82稳定细胞FLNa mRNA的水平,稳定转染FLNa siRNA的GLC-82细胞FLNa mRNA的相对定量值(0.38±0.23)明显低于对照组细胞(1.00),有统计学意义(P<0.05)。2.2Western blot检测稳定转染细胞FLNa的表达水平Western blot检测GLC-82稳定转染细胞FLNa的蛋白水平,稳定转染FLNa siRNA的GLC-82细胞FLNa的相对表达量(0.39±0.00),明显低于对照细胞(0.66±0.00),有统计学意义(P<0.05)。3GLC-82稳定转染细胞的增殖、迁移和侵袭情况3.1GLC-82稳定转染细胞的增殖情况将GLC-82稳定转染细胞接种于96孔板,MTT法检测各孔的OD值进行统计分析,分别经0nM、4nM、20nM EGF刺激后各孔的OD值,GLC-82/FLNa siRNA组(0.48±0.02,0.64±0.03,0.70±0.04)各浓度均明显低于对照组(0.55±0.04,0.73±0.05,0.81±0.04),均有统计学意义(P<0.05)。3.2GLC-82稳定转染细胞的迁移情况利用相应软件测量划痕宽度,计算细胞迁移率:细胞迁移率=(划痕初始宽度-划痕目前宽度)/2/划痕初始宽度×100%。无EGF刺激时,降低FLNa表达的GLC-82细胞分别于8h、16h、24h和32h的迁移率(8.11±2.45%,15.78±0.84%,16.23±2.27%,19.89±2.91%)各时间点均低于对照组(15.47±0.74%,21.38±1.66%,25.00±2.17%,30.43±0.11%),均具有统计学意义(P<0.05);GLC-82/FLNa siRNA细胞给予20nM EGF刺激后,各时间点的迁移率明显高于无EGF刺激组;GLC-82/Control细胞给予20nM EGF刺激后,从24h开始细胞迁移率明显高于无EGF刺激组,均有统计学意义(P<0.05)。3.3GLC-82稳定转染细胞的侵袭情况采用Transwell法检测细胞的侵袭能力,GLC-82/FLNa siRNA组穿膜细胞数(192±70)明显低于对照组(368±73),有统计学意义(P<0.05)。4FLNa作用机制的探讨4.1沉默FLNa表达对GLC-82细胞EGFR活化的影响培养GLC-82稳定转染细胞,Western blot检测EGF刺激0min、5min、10min、30min后蛋白的表达情况。统计结果显示,FLNa siRNA组各时间点FLNa的表达量(0.10±0.00,0.28±0.00,0.25±0.00,0.18±0.00)均明显低于对照组(0.52±0.00,0.72±0.00,0.71±0.00,0.73±0.04),均有统计学意义(P<0.01);FLNa siRNA组磷酸化EGFR分别于EGF刺激5min、10min、30min后的表达水平(0.74±0.00,0.53±0.00,0.23±0.00)均明显低于对照组(0.81±0.00,0.68±0.00,0.60±0.02),均有统计学意义(P<0.01);FLNa siRNA组磷酸化ERK分别于EGF刺激5min、10min、30min后的表达水平(0.32±0.00,0.40±0.00,0.31±0.00)均明显低于对照组(0.38±0.01,0.63±0.00,0.98±0.01),均有统计学意义(P<0.01)。4.2IP证实FLNa对EGFR活化的影响经抗EGFR抗体免疫沉淀后,用抗酪氨酸磷酸化的抗体4G10进行印迹,观察EGFR磷酸化水平: EGF刺激5min后,FLNa siRNA组EGFR相对磷酸化水平(0.95±0.03)明显低于对照组(1.16±0.01),有统计学意义(P<0.01)。结论:1肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力与FLNa的表达水平密切相关,降低FLNa的表达水平可减弱肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,表明FLNa对肺腺癌细胞的增殖、转移具有促进作用。2肺腺癌细胞EGFR的磷酸化水平是影响肺癌发展的关键;FLNa通过影响肺腺癌细胞EGFR的磷酸化水平,调控Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路,进而影响肺腺癌细胞的增殖和转移。