【摘 要】
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研究背景:人胚胎干细胞是一类可以在体外连续稳定传代培养并且具有三胚层组织细胞分化潜能的多能干细胞。经过适当条件的刺激,可以分化形成多种具有临床应用前景的细胞,为再生医学的发展奠定了坚实的基础,同时也为发育生物学的研究提供了很好的材料。根据早期对于小鼠胚胎干细胞以及人的胚胎干细胞的研究,一般将胚胎干细胞分为naive与primed两个状态,naive状态的胚胎干细胞类似于植入前囊胚的内细胞团,而pr
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研究背景:人胚胎干细胞是一类可以在体外连续稳定传代培养并且具有三胚层组织细胞分化潜能的多能干细胞。经过适当条件的刺激,可以分化形成多种具有临床应用前景的细胞,为再生医学的发展奠定了坚实的基础,同时也为发育生物学的研究提供了很好的材料。根据早期对于小鼠胚胎干细胞以及人的胚胎干细胞的研究,一般将胚胎干细胞分为naive与primed两个状态,naive状态的胚胎干细胞类似于植入前囊胚的内细胞团,而primed状态的胚胎干细胞则更类似于植入后胚胎的上胚层细胞。Naive与primed胚胎干细胞之间的内在差异,导致了其具有不同的特点以及应用前景。因此,目前不少科研人员致力于将传统的人的胚胎干细胞从primed状态诱导至naive状态,以期望发挥人胚胎干细胞最大的应用价值。要充分发挥胚胎干细胞的应用潜力,首先要了解其命运是如何决定的,即细胞的自我更新是如何维持的,以及细胞是如何退出多能性并分化为特定细胞谱系的。Naive与primed干细胞有着不同的多能性维持及退出的调控机制,主要表现为naive状态的胚胎干细胞主要以LIF/STAT3及WNT/β-Catenin信号通路维持其未分化状态,而primed则主要以FGF/ERK以及TGFβ/Smad2/3维持其多能性,另外,不少研究报道显示,BMP4/Smad1/5以及Insulin/JNK在胚胎干细胞的多能性维持或退出过程中同样发挥了重要的调控作用。ID1与ID3（IDs）共同属于HLH蛋白家族,二者互相协同,在胚胎的发育中起到了重要的调控功能。ID1与ID3在胚胎干细胞中可以被包括BMP4/Smad1/5在内的信号通路激活,但其在维持人primed及naive胚胎干细胞自我更新方面的作用还不是很清楚。研究目的:探索ID1与ID3在协同调控人primed以及naive胚胎干细胞自我更新的维持以及多能性退出过程中的调控作用,为全面了解人胚胎干细胞自我更新维持机制及细胞命运选择提供新思路,为发挥胚胎干细胞最大应用价值奠定基础。实验方法:（1）分别观察ID1与ID3的单敲与双敲对primed胚胎干细胞生存及增殖能力的影响;（2）分别观察ID1与ID3的单敲与双敲对于primed干细胞多能性维持以及在EB分化过程中对干细胞多能性退出及三胚层分化的影响;（3）ID1过表达primed在胚胎干细胞多能性维持及退出过程中的作用;（4）利用单细胞测序分析揭示ID1/3对于primed胚胎干细胞自我更新调控的机制;（5）建立人naive胚胎干细胞培养体系,并观察ID1/3的单敲与双敲对于人naive状态胚胎干细胞自我更新维持的影响;（6）观察naive状态胚胎干细胞对照系及ID1/3敲除系在滋养层干细胞分化中的差异;（7）结合单细胞测序数据以及相关报道,分析ID1/3对于维持人naive状态胚胎干细胞自我更新的调控机制。实验结果:在primed与naive状态的胚胎干细胞中,ID1与ID3的双敲使单细胞的生存能力降低,在加入Y27632之后,细胞的生存能力恢复。另外,ID1/3的双敲,可以延长胚胎干细胞细胞周期的G1期,缩短S期。ID1/3的敲除,使得primed与naive状态的胚胎干细胞多能性标志基因表达下降,其中在naive胚胎干细胞中,naive状态的标志基因下调幅度更大。在EB分化过程的早期阶段,ID1/3的敲除,会使得primed状态的胚胎干细胞的多能基因表达迅速下调,即促进胚胎干细胞多能性的退出,与此同时,外胚层相关基因表达升高。在EB分化的后期,ID1/3的敲除使胚胎干细胞的中内胚层分化受到限制。在naive状态胚胎干细胞向滋养层胚胎干细胞分化中,ID1/3的双敲,使得滋养层干细胞的分化受到限制。单细胞测序以及后续的Western blot验证结果显示,ID1/3的敲除降低胚胎干细胞中AKT的磷酸化水平,而ID1的过表达可以促进AKT的磷酸化,结合已有的相关报道,发现ID1/3可以通过AKT信号通路调控primed及naive状态的胚胎干细胞自我更新的维持。另外,ID1/3可以直接通过与TCF3的相互作用,促进naive状态胚胎干细胞多能性标志基因的表达。结论:研究发现,ID1/3通过AKT信号通路,在调控人primed及naive状态的胚胎干细胞多能性维持以及退出过程中具有重要的作用。
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