具有良好生物活性的天然产物中有很多属于聚酮(Polyketides，PKs)、非核糖体肽（或称聚肽，Noribosomal Peptides，NRPs）或聚酮-聚肽杂合类（PK-NRPhybrids）化合物，如临床上广泛使用的抗生素红霉素、万古霉素和抗癌药物埃博霉素等。这些化合物骨架的生物合成大多以一个或多个酶组成的多模块装配线为模板，指导分子骨架的线性聚合:每个模块负责一个特异单体的组装，最终按序延伸的线性中间体从装配线上释放下来，作为进一步修饰的生物合成前体。在这样的机制下，骨架的多样性很大程度上取决于装配线上和线下各种修饰的不同。本文选择了两条极具代表性的PK-NRP装配线作为对象，对其装配线上的修饰机制开展了研究。　　一联吡啶类抗生素核心骨架生物合成机制研究　　青蓝霉素(Caerulomycins，CAEs)和克里斯霉素(Collismycins，COLs)均具有类似的联吡啶核心骨架，两者结构最主要的区别在A环5位:COLs都有含硫基团的取代而CAEs没有取代。前期工作通过基因功能分析推测这两个联吡啶核心骨架是由一对组织结构完全相同的PK-NRP杂合装配线所合成。因此，该装配线至少有两个方面体现了特殊的线上修饰:产物是罕见的联吡啶全芳香骨架，而非常见的线形或大环结构;完全相同组织结构的装配线合成了两种不同的核心骨架，脱离了经典装配线合成中产物与模块一一对应原则。针对该装配线特性我们展开了本文第一部分的研究。　　在本课题组前期工作基础上，首先我们根据生物信息学分析结果，通过喂养推测的标记前体，明确了联吡啶骨架各原子的前体来源;同时通过基因敲除，确定了联吡啶骨架生物合成与编码装配线蛋白的基因的相关性。然后，对两种核心骨架生物合成进行了体外重构，确定了其生物合成所有必需的因子。最后，我们以体外重构体系为平台开展了机制研究，确定核心骨架在装配线上的形成时间和两种核心骨架的差异性来源。　　通过以上实验，我们确定了两个结构类似的联吡啶核心骨架B环来自赖氨酸转化的吡啶甲酸， A环来自一分子的乙酸单元和一分子的半胱氨酸。这些底物在一条由Cae/ColA1，Cae/ColA2和CaeA3/ColA3组成的4模块的PK-NRP杂合装配线为模板下进行组装，当组装进行到第三模块时，装配线上环化功能域Cy、未知功能的Ct功能域和一个外来氧化还原蛋白Cae/ColB1的修饰作用使本为链状的中间体环化、重排为全芳香的联吡啶。装配线上最后一个模块的NRP合酶催化的“隐藏的”亮氨酸组装则可能通过蛋白-蛋白相互作用间接参与了在第三模块上的反应并带来了底物的差异性，该模块作用后，带有亮氨酸残基的核心骨架从线上释放并立即由后修饰酶对该亮氨酸残基水解切除。二大环类免疫抑制剂萨菲菌素生物合成中起始单元的上载机制研究　　免疫抑制剂萨菲菌素(Sanglifehrin，SFs)是典型的由PK-NRP杂合装配线合成的大环产物。该装配线的起始模块仅由一个独立的载体蛋白构成，并且基因簇中也没有发现任何已有报道的离线上载机制的相关基因，因此我们推测其起始单元乙基丙二酸单酰胺的上载是采用了全新的机制。针对这种新颖的起始模块修饰方式开展了本文第二部分的研究。　　在本课题组前期工作基础上，我们首先通过生物信息学分析，确定了负责起始单元上载的基因。然后，我们表达了这些基因所编码的蛋白并成功完成了体外的起始单元上载测试。最后，我们使用体外的起始单元上载测试体系，对该过程的底物容忍性进行了研究。　　通过以上实验，我们确定了SFs的PK-NRP杂合装配线采用了一种新颖起始模块上载机制:起始底物首先通过自酰化作用上载到一个独立的载体蛋白，再由一个KSⅢ蛋白催化底物向装配线上的转移。该KSⅢ蛋白对底物结构变化容忍性较大，但唯独对末端未酰胺化的非成熟底物不具有转移活性。因此，我们推测SFs的装配线使用这种起始单元的上载机制保证了相关底物修饰的彻底性，避免了最后副产物的产生。实验结果也为相关类似产物的组合生物合成提供了理论基础。