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第一部分无血清培养、化疗及放疗富集前列腺癌干细胞的研究目的：肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs)的发现为肿瘤研究及治疗带来了新的希望,但由于其在肿瘤细胞中所占比例极低,较难获得数量充足的CSCs以对其进行深入的研究。因此,我们采用三系前列腺癌细胞通过无血清悬球培养法、化疗药物法及放射治疗法三种方法分别富集前列腺癌干细胞,为前列腺癌干细胞领域的研究奠定基础。方法：分别用含血清的培养基及添加了人表皮生长因子(EGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和人白血病抑制因子(LIF)的无血清培养基培养DU145、PC-3、LNCap前列腺癌细胞,流式细胞仪检测两种不同培养条件下三系细胞中CD133+/CD44+前列腺癌干细胞的含量。采用无血清悬球培养法、化疗药物法(多西紫杉醇0.1μM)及放射治疗法(4Gy/次,2次／周,连续照射两周)三种方法分别富集DU145细胞中CD133+/CD44+前列腺癌干细胞,并使用流式细胞仪检测三种方法富集后DU145细胞中CD133+/CD44+前列腺癌干细胞的含量。结果：在含血清的常规贴壁培养条件下,三系细胞中仅有DU145细胞能检测到CD133+/CD44+细胞,且含量极低(0.1%±0.01%)。少量DU145细胞和PC-3细胞能够在无血清培养基中存活并形成悬浮细胞球,且无血清悬球培养后两种细胞中CD133+/CD44+前列腺癌干细胞比例显著增高(DU145:10.3%; PC-3:3.0%)。使用化疗药物多西紫杉醇富集后DU145细胞中CD133+/CD44+前列腺癌干细胞比例增高至9.8%,放疗富集后DU145细胞中CD133+/CD44+前列腺癌干细胞比例增高至3.5%。结论：常规培养条件下,前列腺癌三系细胞仅DU145细胞系中可检测到极微量的CD133+/CD44+前列腺癌干细胞。经无血清悬球培养富集后,在DU145及PC-3细胞系中可检测到CD133+/CD44+前列腺癌干细胞,而LNCap细胞中未能检测到。通过化疗及放疗富集后,DU145细胞中CD133+/CD44+前列腺癌干细胞比例明显上升。无血清培养、化疗及放疗三种方法均能有效富集CD133+/CD44+前列腺癌干细胞,为后期前列腺癌干细胞特性研究奠定基础。第二部分CD133+/CD44+前列腺癌干细胞特性研究目的：肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs)具有无限增殖、自我更新及多向分化潜能,是“肿瘤的种子”,是驱动肿瘤形成和生长、保持肿瘤异质性并促进肿瘤无限增殖、复发和转移的根源,也是化疗和放疗抵抗的重要原因之一。我们将富集、分选出的CD133+/CD44+前列腺癌干细胞通过体内、体外实验进一步证实其CSCs特性。方法：DU145细胞经无血清培养富集后,利用流式细胞仪分选出CD133+/CD44+前列腺癌干细胞。平板克隆形成实验及Transwell细胞侵袭实验比较CD133+/CD44+DU145细胞和未分选亲代DU145细胞的增殖能力及侵袭性的差异。20只雄性BALB/c裸鼠,随机分为实验组(10只)及对照组(10只),分别皮下注射CD133+/CD44+DU145细胞(1×104)及未分选亲代DU145细胞(1×106),比较二者体内致瘤能力的差异。结果：研究结果显示,在平板克隆形成实验中CD133+/CD44+DU145细胞的克隆形成率(colony-formation efficiency, CFE)为68.5±4.7%,而未分选亲代DU145细胞的CFE为19.7±3.4%,差异有统计学意义(P<0.001)。在Transwell细胞侵袭实验中,显微镜下计数穿透小室膜的CD133+/CD44+DU145细胞数与未分选亲代DU145细胞数分别为416±47与109±24,差异有统计学意义(P<0.001)。在裸鼠移植瘤实验中,实验组中10只裸鼠全部荷瘤成功,而对照组中仅有5只裸鼠荷瘤成功,同时实验组的出瘤时间早于对照组,且出瘤后生长速度显著快于对照组(P<0.001)。结论：体外和体内实验证实CD133+/CD44+DU145细胞与未分选亲代DU145细胞相比具有更高的增殖、侵袭能力及更强的致瘤能力,证实其具有干细胞特性,为前列腺癌干细胞。第三部分Notch-1在前列腺癌干细胞化疗耐药中的作用研究目的：目前针对肿瘤干细胞(Cancer stem cells.CSCs)耐药机制的研究,成为干细胞研究领域的热点也是难点。肿瘤干细胞产生耐药的机制相当复杂,目前尚不完全清楚。Notch信号通路在进化上高度保守,调控着细胞的增殖、分化、生存和凋亡,在细胞命运决定中起关键作用。最近的研究显示Notch信号通路与肿瘤耐药有关,NOtch通路能调控CSCs的形成以及上皮间质化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT),这都与肿瘤的化疗耐药密切相关.以Notch信号通路为靶标的基因疗法及新药开发将为肿瘤耐药,特别是CSCs耐药研究开辟新的领域。我们将进一步探讨Notch-1在CD133+/CD44+前列腺癌干细胞化疗耐药中的作用,以期为前列腺癌的治疗提供新的靶点。方法：MTT实验分别检测CD133+/CD44+DU145细胞及未分选亲代DU145细胞对化疗药物多西紫杉醇的敏感性。Real-time PCR分别检测两者中干细胞特有基因(Oct-4、Nanog)和Notch-1mRNA表达量的差异。6-8周的雄性BALB/c裸鼠16只,DU145细胞裸鼠移植瘤造模成功后,随机分为两组,实验组(8只),给予多西紫杉醇化疗,剂量为10mg/kg,每周一次,连续3周；对照组(8只)：未行化疗。3周后,裸鼠被处以安乐死,分别剥取对照组裸鼠皮下移植瘤及实验组裸鼠皮下残存肿瘤行Notch-1、Jagged-1的检测及流式细胞检测CD133+/CD44+前列腺癌干细胞的含量。结果：研究结果显示,在MTT实验中给予不同浓度化疗药物多西紫杉醇48h后,CD133+/CD44+DU145细胞存活显著多于未经分选的亲代DU145细胞(P<0.05),与第一部分实验中化疗富集CD133+/CD44+DU145前列腺癌干细胞结果一致。在相同多西紫杉醇浓度下,其对CD133+/CD44+DU145细胞的抑制率显著低于亲代DU145细胞,多西紫杉醇对CD133+/CD44+DU145细胞及亲代DU145细胞的IC50分别为0.075μM和0.665μM,耐药指数为8.87。Real-time PCR实验结果显示CD133+/CD44+DU145细胞与未分选亲代DU145细胞相比,高表达干细胞特定基因：Nanog、Oct-4,并且Notch-1表达水平显著增高(P<0.01)。裸鼠移植瘤实验中,实验组与对照组相比,Notch-1、Jagged-1表达明显增高；流式细胞检测实验组残存肿瘤中CD133+/CD44+前列腺癌干细胞比例显著高于对照组(实验组：2.6%；对照组：0.1%)。结论：CD133+/CD44+DU145前列腺癌干细胞对多西紫杉醇具有化疗耐药性,且高表达Notch-1。化疗后残存肿瘤高表达Notch-1、Jagged-1,且CD133+/CD44+前列腺癌干细胞比例显著升高,提示CD133+/CD44+前列腺癌干细胞对化疗耐药,Notch-1可能在前列腺癌干细胞化疗耐药中起一定作用。