论文部分内容阅读
目的：建立变性高效液相色谱法（DHPLC）快速筛选同一个体不同组织线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）高变区异质型的方法；同时采用直接测序法验证其发生的频率，为利用mtDNA进行法医学鉴定时作出更加合理的结果解释提供参考。 方法：收集尸体18例，分别提取血、心肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、脑组织、肌肉、皮肤、肋骨、指甲及毛发的mtDNA，共制备样本234份；并且在本实验室选取三个已知序列的样本Y1、Y2和Y3。在高变区选取两个多态性较好的区域即HV Ⅰ：nt16159-16391和HV Ⅱ：nt172-408，选用GoldTM DNA聚合酶分别进行扩增并且优化扩增条件。用已知序列的样本建立两个区域各自最佳的DHPLC检测条件；采用DHPLC图谱和直接正反向测序法均相同的1#个体的所有样本建立筛选不同组织间异质型的模型。利用DHPLC筛选异质型样本，筛选出的异质型样本扩增更长的片段（包含目的片段）用ABI 310遗传分析仪进行正反向测序验证。 结果：DHPLC的最佳检测温度是HV Ⅰ：59.2℃，HV Ⅱ：55℃。DHPLC共筛选出11例个体具有异质性，而直接测序法验证只有9例个体具有异质性，其中有4例为点异质型，6例为长度异质型，有1例既有点异质型又有长度异质型。观察到异质型的个体中有4例每个个体的所有样本均在相同的位置出现了相同的异质型；有2例出现了两个碱基位置发生异质性的情况。各种组织出现异质型的频率不完全相同，其范围在27.8％-44.4％之间，其中肌肉组织出现的异质性频率最高。在所检出的异质性位点中，nt16184-16193和nt303-309的频率最高。 结论：DHPLC可快速筛选异质性，且经济、灵敏、自动化程度高。随着筛选技术和测序技术的不断发展，在mtDNA可检出的异质型越来越多，这增加了利用mtDNA进行法医学鉴定中结果解释的难度。因此在法医学应用领域必须扩大mtDNA的检测范围以增加个体识别能力。