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调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)是外周免疫耐受的重要机制，Tregs通过释放免疫抑制性细胞因子或者接触抑制T细胞的活化，恰当的Tregs功能对维持机体免疫平衡具有重要作用。Tregs缺陷会导致小鼠和人发生致命的免疫性疾病，而增强的Tregs功能则会导致机体对肿瘤的免疫耐受。在肿瘤微环境和抗肿瘤免疫中Tregs发挥免疫抑制功能，增加的Tregs会导致肿瘤免疫逃逸的发生，从而不利于肿瘤的免疫治疗。因此，探究Tregs的调节机制就显得尤为重要。
可诱导共刺激分子(inducible costimulator，ICOS)，只表达于活化T细胞表面，是CD28家族的成员。根据Tregs的表面是否表达ICOS，可分为ICOS+Tregs和ICOS-Tregs。在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤等肿瘤局部大都是ICOS+Tregs，而在前列腺癌中鲜少有报道。体外培养实验发现，ICOS+Tregs具有更强的生存能力。研究发现，虽然ICOS与CD28结构相似，但却介导着不同的生物活性。ICOS的YMFM基序中缺少天冬酰胺残基，不能结合Grb2。AP1可与NFAT形成二聚体而活化T细胞，Tregs抑制功能的发挥则依赖于Foxp3与NFAT的结合。基于这些理论，我们提出这样的设想:ICOS不能结合Grb2，ICOS无法激活Ras-Erk1/2-AP1通路，无法介导T细胞的活化，在AP1与Foxp3竞争结合NFAT中，抑制AP1/NFAT二聚体的形成，使Foxp3/NFAT二聚体的形成占有优势，最终促进Tregs的功能。能结合PI3K，激活PI3K-Akt通路而产生抗凋亡作用。
目的：
1、探究ICOS+Tregs与前列腺癌的关系。
2、探究ICOS是否无法激活Ras-Erk1/2-AP1通路，促进Foxp3转录增强，最终促进Tregs的功能。
3、探究ICOS是否通过激活PO3K-Akt通路促进Tregs的存活
方法：
1、免疫荧光双染:制备前列腺癌组织石蜡切片，免疫荧光双染检测组织中的Foxp3和ICOS。
2、细胞的获得:无菌制备小鼠脾细胞悬液，采用磁珠分选技术，获得CD4+CD25+Tregs。
3、细胞的培养:CD4+CD25+Tregs在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，分别加入抗CD3抗体和抗CD28抗体或抗ICOS抗体，加入抗CD3抗体(激活TCR)，刺激培养细胞。
4、流式细胞术检测细胞凋亡:收集各刺激组培养的细胞，采用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒，流式细胞仪检测。
5、Westem bloting:提取各刺激组培养的细胞总蛋白，通过Western bloting在分子水平检测Ras、Erk1/2、p-Erk1/2、Akt、p-Akt、Bcl-2表达水平的变化。
6、免疫共沉淀:提取各刺激组培养的细胞总蛋白，用NFAT1抗体免疫沉淀后，通过Western blotillg检测免疫共沉淀的Foxp3和c-Jun水平。
7、Q-PCR:提取各刺激组培养的细胞总I矾A，逆转录成cDNA，荧光定量检测细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β)。
结果：
1、免疫荧光双染法验证了在前列腺癌肿瘤局部浸润的Tregs大都是ICOS+Tregs。
2、为研究ICOS对Tregs的影响，流式细胞仪检测凋亡，结果显示，ICOS有利于Tregs的存活。
3、Western bloting检测，加入抗体刺激培养Tregs4天后细胞中Ras蛋白、Erk1/2蛋白、p-Erk1/2以及与NFAT共沉淀的Foxp3和c-Jun的蛋白变化水平。结果显示，加抗ICOS抗体作用于CD4+CD25+Tregs后，p-Akt，Bcl2蛋白表达上调，说明ICOS可能是通过介导PI3K-Akt通路，抵抗细胞凋亡。Ras蛋白的表达下调，p-Erk蛋白的水平也显著降低，与NFAT共沉淀的c-Jun的蛋白下调，与NFAT共沉淀的Foxp3蛋白上调，说明ICOS通过抑制Ras-Erk1/2-AP1通路，从而促进Tregs的抑制功能。
4、Q-PCR结果显示，ICOS促进Foxp3下游调控基因IL-4、IL-10、TFB-β的表达，抑制AP1的下游调控基因IL-2、IL-6的表达，发挥免疫抑制作用。
结论：
1、在前列腺癌局部浸润的Treg大都是ICOS+Tregs，ICOS+Tregs与前列腺癌的发生呈正相关。
2、ICOS无法激活Ras-Erk1/2-AP1通路，抑制AP1/NFAT二聚体的形成，使Foxp3/NFAT二聚体的形成占有优势，ICOS通过介导细胞因子的分泌，最终促进Tregs的功能。
3、ICOS通过介导PI3K-Akt通路，抵抗细胞凋亡，ICOS有利于Tregs的存活。
可诱导共刺激分子(inducible costimulator，ICOS)，只表达于活化T细胞表面，是CD28家族的成员。根据Tregs的表面是否表达ICOS，可分为ICOS+Tregs和ICOS-Tregs。在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤等肿瘤局部大都是ICOS+Tregs，而在前列腺癌中鲜少有报道。体外培养实验发现，ICOS+Tregs具有更强的生存能力。研究发现，虽然ICOS与CD28结构相似，但却介导着不同的生物活性。ICOS的YMFM基序中缺少天冬酰胺残基，不能结合Grb2。AP1可与NFAT形成二聚体而活化T细胞，Tregs抑制功能的发挥则依赖于Foxp3与NFAT的结合。基于这些理论，我们提出这样的设想:ICOS不能结合Grb2，ICOS无法激活Ras-Erk1/2-AP1通路，无法介导T细胞的活化，在AP1与Foxp3竞争结合NFAT中，抑制AP1/NFAT二聚体的形成，使Foxp3/NFAT二聚体的形成占有优势，最终促进Tregs的功能。能结合PI3K，激活PI3K-Akt通路而产生抗凋亡作用。
目的：
1、探究ICOS+Tregs与前列腺癌的关系。
2、探究ICOS是否无法激活Ras-Erk1/2-AP1通路，促进Foxp3转录增强，最终促进Tregs的功能。
3、探究ICOS是否通过激活PO3K-Akt通路促进Tregs的存活
方法：
1、免疫荧光双染:制备前列腺癌组织石蜡切片，免疫荧光双染检测组织中的Foxp3和ICOS。
2、细胞的获得:无菌制备小鼠脾细胞悬液，采用磁珠分选技术，获得CD4+CD25+Tregs。
3、细胞的培养:CD4+CD25+Tregs在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，分别加入抗CD3抗体和抗CD28抗体或抗ICOS抗体，加入抗CD3抗体(激活TCR)，刺激培养细胞。
4、流式细胞术检测细胞凋亡:收集各刺激组培养的细胞，采用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒，流式细胞仪检测。
5、Westem bloting:提取各刺激组培养的细胞总蛋白，通过Western bloting在分子水平检测Ras、Erk1/2、p-Erk1/2、Akt、p-Akt、Bcl-2表达水平的变化。
6、免疫共沉淀:提取各刺激组培养的细胞总蛋白，用NFAT1抗体免疫沉淀后，通过Western blotillg检测免疫共沉淀的Foxp3和c-Jun水平。
7、Q-PCR:提取各刺激组培养的细胞总I矾A，逆转录成cDNA，荧光定量检测细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β)。
结果：
1、免疫荧光双染法验证了在前列腺癌肿瘤局部浸润的Tregs大都是ICOS+Tregs。
2、为研究ICOS对Tregs的影响，流式细胞仪检测凋亡，结果显示，ICOS有利于Tregs的存活。
3、Western bloting检测，加入抗体刺激培养Tregs4天后细胞中Ras蛋白、Erk1/2蛋白、p-Erk1/2以及与NFAT共沉淀的Foxp3和c-Jun的蛋白变化水平。结果显示，加抗ICOS抗体作用于CD4+CD25+Tregs后，p-Akt，Bcl2蛋白表达上调，说明ICOS可能是通过介导PI3K-Akt通路，抵抗细胞凋亡。Ras蛋白的表达下调，p-Erk蛋白的水平也显著降低，与NFAT共沉淀的c-Jun的蛋白下调，与NFAT共沉淀的Foxp3蛋白上调，说明ICOS通过抑制Ras-Erk1/2-AP1通路，从而促进Tregs的抑制功能。
4、Q-PCR结果显示，ICOS促进Foxp3下游调控基因IL-4、IL-10、TFB-β的表达，抑制AP1的下游调控基因IL-2、IL-6的表达，发挥免疫抑制作用。
结论：
1、在前列腺癌局部浸润的Treg大都是ICOS+Tregs，ICOS+Tregs与前列腺癌的发生呈正相关。
2、ICOS无法激活Ras-Erk1/2-AP1通路，抑制AP1/NFAT二聚体的形成，使Foxp3/NFAT二聚体的形成占有优势，ICOS通过介导细胞因子的分泌，最终促进Tregs的功能。
3、ICOS通过介导PI3K-Akt通路，抵抗细胞凋亡，ICOS有利于Tregs的存活。