透骨草Phryma leptostachya是透骨草属多年生草本植物,作为天然杀虫剂防治菜青虫、蝇蛆等害虫的杀虫剂历史悠久。透骨草主要杀虫活性成分为具有3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octane骨架的二氧双环辛烷木脂素A（双氧木脂素A,haedoxan A,HA）。前期研究发现HA对多种农林、卫生害虫有很好的毒杀效果,尤其在胡椒基丁醚（Piperonyl butoxide,PBO）的协同作用下,HA对家蝇（Musca domestica）的杀虫活性与拟除虫菊酯类杀虫剂溴氰菊酯相当。此外,HA对淡色库蚊（Culex pipiens pallens）幼虫也表现出优异的杀虫潜力。这些结果表明HA作为植物源杀虫剂进行研发具有重要的经济价值。此外,症状学观察发现,经过HA处理的昆虫表现出典型的神经中毒的兴奋性症状。电生理试验的研究结果进一步表明HA不仅使黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）敏感型电压门控钠离子通道（voltage-gated sodium channels,VGSCs）的失活门控向超极化方向移动,还可以延缓黑腹果蝇神经突触以及感觉神经-中枢神经-运动神经回路的兴奋性电位频率的衰减。因此,综合已有的试验结果推测HA主要作用于昆虫的神经系统或肌肉系统,然而,HA具体的杀虫作用靶点至今仍未阐明。为此,为了明确植物源杀虫活性成分HA的作用机理及其作用靶点,本文从两个角度进行了相关研究:一方面,通过分子生物学和双电极电压钳技术阐明HA对昆虫钠通道的作用机理,同时结合同源建模和分子对接明确HA在VGSCs上的作用位点,并利用细胞毒性试验对HA进行哺乳动物安全性的探讨。另一方面,培育抗二氧双环辛烷木脂素A（haedoxan A-resistant）的埃及伊蚊HAR品系,以埃及伊蚊敏感品系Waco和抗菊酯类杀虫剂品系Puerto Rico为参照,系统性评估HA对埃及伊蚊的毒杀活性及其抗性风险,并应用蛋白组学技术明确HAR品系的抗性机制。全文的主要研究结果如下所示:1.基于爪蟾卵母细胞异源表达昆虫钠通道的双电极电压钳研究表明,HA主要通过干扰昆虫VGSCs失活门控中的快失活门控,破坏正常的神经传导过程,引起神经系统紊乱,导致昆虫神经性中毒;定点突变的功能验证发现德国小蠊VGSCs上264位置的异亮氨酸（Ile）、434位置的谷氨酸（Glu）和993位置的亮氨酸（Leu）可能是HA结合位点的氨基酸。同源建模和分子对接表明,HA在VGSCs中由结构域Ⅰ和Ⅱ的电压传感结构域（VSD）以及结构域Ⅰ的S4-S5跨膜片段连接区所构成的活性腔内有多个结合位点,该活性腔与拟除虫菊酯类的两个结合位点（ⅡL45-ⅡS5-ⅡS6-ⅢS6和ⅠL45-ⅠS5-ⅠS6-ⅡS6）多有重叠,这些结果表明HA与拟除虫菊酯类杀虫剂在VGSCs上的结合位点部分重叠或变构耦联。2.高浓度的HA对大鼠r Nav1.2和r Nav1.4敏感型VGSCs的快失活门控特性无明显影响,即哺乳动物的钠通道对HA不敏感,说明HA对昆虫和哺乳动物钠通道存在明显的选择性;对小鼠胚胎成纤维细胞HEK293和人胚胎肾细胞HEK293的增殖抑制作用小于氯菊酯,氯菊酯对NIH-3T3的抑制中浓IC50为69.04μM,对HEK293的IC50大于300μM,而HA对两个哺乳动物细胞的IC50均大于300μM,表现出明显的低细胞毒性。3.对埃及伊蚊敏感品系Waco的3龄幼虫进行了间隔30代的HA抗性选育,培育出了HAR品系。试验结果显示HAR品系第29代幼虫对HA的抗性为Waco的31.579倍;HAR品系的种群抗性现实遗传力较低,抗性风险评估显示3龄埃及伊蚊幼虫对HA抗性增长10倍所需的世代数为18代,表明在野外条件下埃及伊蚊不易对HA产生抗性。4.以Waco、HAR和Puerto Rico品系幼虫对应的胡椒基丁醚（PBO）、磷酸三苯酯（Triphenyl phosphate,TPP）和马来酸二乙酯（Diethyl maleate,DEM）的亚致死剂量LC10处理3龄幼虫,结果发现均对HA有明显的增效作用。HAR品系(G19)中,PBO、DEM和TPP对HA的增效倍数分别为16.580、4.895和3.146倍,增效作用显著。同时,PBO对Waco品系3龄幼虫的增效倍数为8.675倍。以上结果表明细胞色素P450酶系不仅参与了埃及伊蚊对HA的体内代谢解毒,也参与了HAR品系的抗性发展过程。对HAR品系的交互抗性测定表明,HA与拟除虫菊酯类杀虫剂氯菊酯和氯氰菊酯以及DDT具有轻微的交互抗性,抗性比分别为4.763、3.125和5.744倍,推测该交互抗性由HA的靶标位点与菊酯类杀虫剂和DDT相关联引起;HA与新烟碱类杀虫剂吡虫啉和有机磷杀虫剂毒死蜱无明显交互抗性,抗性比分别为1.901和1.023倍;和噁二嗪类杀虫剂茚虫威、抗生素类杀虫剂阿维菌素表现出一定负交互抗性,抗性倍数分别为-1.913和-1.378倍。5.蛋白组学分析表明,埃及伊蚊HAR品系(G19)的3龄幼虫与敏感品系Waco的幼虫相比,体内细胞色素P450酶系（CYP）的多种酶蛋白在蛋白表达水平上至少上调了1.5倍,例如与杀虫剂抗性相关的CYP4、CYP6和CYP9家族蛋白中的P4504g15、P450 6a14和P450 9f2;Real-time q PCR证实HAR品系这些基因的转录水平比Waco品系高5～20倍。蛋白组学结果还表明HAR(G19)品系幼虫的Cuticle Protein 19.8、Larval Cuticle A2B和Cuticle Protein 8等角质蛋白明显上调,RT-q PCR结果显示这些基因在转录水平提高了200～700倍,与Waco相应基因的转录水平相比,差异十分显著。因此,以细胞色素P450酶系为主介导的代谢抗性和穿透抗性是HAR品系(G19)的主要抗性机制。此外,蛋白组学分析和RT-q PCR验证还发现HA通过诱导生长抑制因子（Inhibitor of Growth Protein）等蛋白的过表达进而延缓幼虫的生长发育过程,直接导致埃及伊蚊HAR品系幼虫历期的延长。综上所述,本论文解析了杀虫植物透骨草杀虫成分二氧双环辛烷木脂素A（HA）以昆虫电压门控钠离子通道（VGSCs）为靶标的作用机制,并阐明了HA与拟除虫菊酯类杀虫剂在VGSCs上作用位点的部分重叠或变构耦联关系;证实HA对昆虫和哺乳动物VGSCs具有一定的选择毒性,并对哺乳动物表现出低细胞毒性,初步表明其对哺乳动物比较安全;培育了埃及伊蚊HAR品系并进行了抗性风险评估,发现代谢抗性和穿透抗性增强是埃及伊蚊HAR品系产生抗性的机制。这些研究为以HA为主要杀虫成分或先导化合物的植物源杀虫剂研发奠定了基础。