论文部分内容阅读
利用鱼皮胶原蛋白制备具有生物活性的胶原肽,是鱼类下脚料综合利用的有效途径之一。本研究以鲨鱼皮和罗非鱼皮为原料提取胶原制备胶原肽,通过比较两种胶原理化性质和酶解特性,研究胶原肽的抗氧化活性与氨基酸序列之间的构效关系,优化胶原肽脱色工艺,探讨胶原肽对人皮肤细胞生长的影响,为利用胶原肽开发保健食品、化妆品提供参考。本文首先利用酸法从鲨鱼（Prionace glanca）皮和罗非鱼（Tilapia zillii）皮中提取胶原,通过氨基酸分析,SDS-PAGE,红外和高效液相等相关技术考察了海水鱼与淡水鱼胶原之间理化性质和酶解特性差异。结果发现,鲨鱼皮胶原中异亮氨酸含量大约是罗非鱼皮胶原的2倍,但脯氨酸含量较少。鲨鱼皮胶原α肽链和β肽链的分子量以及胶原热变性温度都低于罗非鱼皮胶原,然而在紫外光谱和红外光谱中没有存在明显的差异。另一方面,电泳图谱和液相图谱都表明,鲨鱼皮胶原和罗非鱼皮胶原容易被胶原酶和胰蛋白酶酶解,不易被木瓜蛋白酶酶解。GPC软件分析发现,经胶原酶酶解240 min后,鲨鱼皮胶原肽中小于1000Da的含量高达23%,而罗非鱼胶原肽中却只有17%。其次,采用复合酶解制备胶原肽,通过凝胶层析,高效液相,质谱和多肽合成等相关技术考察了胶原抗氧化肽的构效关系。结果发现,酶解制备的胶原肽分子量主要集中在150-2000 Da。经过Sephadex G-15凝胶层析分离,不管是鲨鱼皮胶原肽还是罗非鱼皮胶原肽,都是由3个组分组成,分子量最小组分（组分C）抗氧化活性最强。鲨鱼皮胶原肽来源的组分C清除DPPH自由基和羟自由基的IC50值分别为0.57 mg/mL和2.04 mg/mL,而罗非鱼胶原肽来源的组分C却分别为5.09 mg/mL和0.76 mg/mL。通过RP-HPLC分离和质谱分析,发现该组分主要由谷氨酸-甘氨酸-精氨酸（EGR）、甘氨酸-脯氨酸-精氨酸（GPR）、甘氨酸-酪氨酸（GY）和甘氨酸-苯丙氨酸（GF）等4种寡肽,以及精氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等4种氨基酸组成。其中抗氧化性最强的小肽是GY,其清除DPPH自由基和清除羟自由基的IC50值分别为5.08 mg/mL和0.42 mg/mL,此外酪氨酸具有一定的抗氧化活性,其清除DPPH自由基和清除羟自由基IC50值分别为4.70 mg/mL和0.20 mg/mL。然后利用活性炭、大孔树脂对胶原肽进行脱色,通过氨基酸分析和高效液相等研究了活性炭和大孔树脂的脱色工艺及脱色对胶原肽的分子量分布和氨基酸组成的影响。结果发现,在活性炭脱色最佳脱色条件下,鲨鱼皮胶原肽脱色率、肽损失率分别为95.47%、10.60%,罗非鱼皮胶原肽分别为92.66%、11.23%;而大孔树脂在最佳脱色条件下,鲨鱼皮胶原肽脱色率、肽损失率分别为79.67%、32.00%,罗非鱼皮胶原肽分别为83.02%、30.77%,脱色效果明显不及活性炭。另一方面,根据胶原肽分子量分布和氨基酸组成分析结果,发现经活性炭、大孔树脂脱色后,鱼皮胶原肽中分子量500-1000 Da组分比例明显减少,Tyr和Phe等氨基酸含量显著下降。最后通过测定细胞增殖,蛋白含量,SOD活力和MDA含量研究了胶原抗氧化肽对角质细胞生长的影响。结果发现,在细胞生长对数期阶段,鱼类胶原抗氧化肽的添加对Hacat细胞的增殖存在显著影响,其中鲨鱼皮胶原肽最佳浓度为0.20 mg/mL、罗非鱼皮胶原肽最佳浓度为0.10 mg/mL。在最佳浓度下,不管是添加鲨鱼皮胶原肽还是添加罗非鱼胶原肽,细胞中蛋白含量和SOD活力都得到明显的提高,而MDA的生成明显得到抑制。然而,当进一步提高鲨鱼皮胶原肽添加量时,这些效果会出现一定程度的下降,而提高罗非鱼皮胶原肽的添加量不会出现这种现象。另一方面,不管是鲨鱼皮胶原肽还是添加罗非鱼胶原肽,利用Sephadex G-15凝胶层析分离的组分C都比单组分GY肽或酪氨酸具有更好的促进细胞增殖能力,在提高细胞的SOD活力和抑制MDA的生成方面甚至比添加谷胱甘肽还要优越。综上所述,鲨鱼皮胶原与罗非鱼皮胶原虽然在理化性质、酶解特性,以及酶解制备的胶原肽在分子量分布和抗氧化活性上都存在一定程度的差异,但胶原肽中抗氧化主要成分都是GY和酪氨酸,表明小分子胶原肽制备工艺优化需要考虑深海鱼与淡水鱼之间的差别,但抗氧化胶原肽的制备不需要考虑海水鱼与淡水鱼原料间的区别。利用胶原肽抗氧化可明显抑制角质细胞的衰老,而且鲨鱼皮胶原肽具有明显的量效关系,表明鱼类胶原肽的应用中需要考虑深海鱼与淡水鱼之间的差别。其中,胶原肽分离组分C是胶原肽抗衰老的活性成分,并通过协同效应抑制皮肤衰老。本研究的结果表明,利用鱼皮下脚料可以制备具有抗氧化和抗衰老特性的胶原肽,实现鱼类胶原蛋白的有效开发利用。