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膀胱肿瘤在泌尿系肿瘤中位居首位,膀胱肿瘤的术后复发问题一直是临床上备受重视的问题。保留膀胱的手术虽然为患者带来好的生活质量,若一旦复发,患者将受到精神和身体上的双重打击。膀胱肿瘤术后可因致癌物质的继续作用、肿瘤多中心生长、手术导致的肿瘤细胞脱落种植以及残留病灶等因素而复发,而药物膀胱灌注后肿瘤的复发率仍很高的原因和肿瘤的多细胞株及肿瘤细胞的多药耐药性有很大关系。目前预防复发的方法主要是单一药物膀胱灌注,虽然也有双药联合应用使复发率降低的报道,但效果不甚理想,而且药物灌注的一些并发症也给患者带来很大的痛苦。本研究力图在前人研究成果的基础上推陈出新,坚持疗效和经济的最好性价比的原则,改进使用方法,提高疗效,造福患者。我们选用了吡柔比星、羟基喜树碱和丝裂霉素C三种常见而作用机理不同的抗肿瘤药物进行研究,采用三药联合的方法来预防膀胱肿瘤的术后复发,在体外实验和临床人体实验中对3种药物单独及联合应用方案进行了对比观察,并对相关的疗效进行了分析。本研究具体工作如下:1.耐药细胞的建立及鉴定本研究通过成功建立耐药细胞株T-24/THP、T-24/HCPT、T-24/MMC的体外细胞模型,并检测各耐药细胞的倍增时间,绘制出生长曲线,对耐药细胞进行鉴定。结果为,MTT法显示三药联合抑制率明显高于单独用药和双药联合用药;HCPT对T-24/MMC细胞和T-24细胞的抑制率存在差别,MMC对T-24/THP细胞和T-24细胞的抑制率存在差别,其余各组均无差别。本研究成功在体外建立T-24细胞的耐药模型,且发现T-24/MMC对HCPT存在耐药性,T-24/THP对MMC存在耐药性。2.耐药细胞的基因及表达的检测本研究应用免疫细胞化学法、PCR-SSCP、RT-PCR等方法检测建立的3种耐药细胞株中P53基因的突变情况.MDR-1基因表达的变化以及Bcl-2基因的表达变化。结果发现:各耐药细胞中P53发生突变,T-24/THP和T-24/MMC出现MDR-1的表达,T-24/MMC中Bcl-2基因过度表达。说明P53出现突变、MDR-1和Bcl-2过度表达均不同程度参预了膀胱肿瘤耐药的产生,但三药联合能很大程度上克服这种耐药性的产生。3.三药的效果基础研究和临床观察本研究应用MTT法和TUNEL法检测药物对肿瘤细胞的抑制率和凋亡指数,采用如下方案对T-24细胞作用:1.每种药物分别单独作用2.三种药物两两组和序贯联合作用3.三种药物联合序贯作用。通过三种方案对T-24细胞的增殖的抑制和诱导调亡的效果的差异,比较三药各方案的抑瘤效果。并根据第一部分的单药耐药细胞株培养的流程尝试建立三药耐药细胞。三种药物轮流使用作用T-24细胞,以比较肿瘤T-24细胞株对三药的耐受能力。同时选取2004-2006年在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院泌尿外科就诊的184例患者,进行了双药和三药联合应用的对照研究。结果为:从抑制率和调亡率上可以看到,双药联合应用较单药有了明显的疗效提高,但较三药方案抑瘤效果差。而临床研究发现,三药联合方案的复发率最低,不良发应也最低。说明吡柔比星、羟基喜树碱和丝裂霉素C三者联合交替应用能显著抑制膀胱肿瘤术后复发,且不良反应较少,较单独用药和双药联合用药效果更佳,是最佳的应用方案。总之,本研究从体外和临床体内实验对膀胱肿瘤的预防和治疗的机理上作了初步研究,为开发吡柔比星、羟基喜树碱和丝裂霉素C的联合应用来防治膀胱肿瘤的复发和不良反应提供了理论基础,并在临床实践中得到了验证。