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目前,我国在食品加工过程中使用的防腐剂主要是化学防腐剂,但是化学防腐剂的使用开始暴露越来越多的潜在危害,因此寻找一种安全的天然防腐剂代替化学防腐剂显得尤为重要。乳酸菌可以产生多种细菌素,由于其具有天然、安全、无毒等特点,在世界各国的的食品保鲜及防止食物变质等领域广泛应用。目前,由乳酸链球菌产生的乳酸链球菌素(Nisin)是唯一得到全世界安全认可的天然食品防腐剂,但Nisin只对革兰氏阳性菌有抑制作用,所以它的抑菌谱窄。因此,对新型细菌素进行开发性研究显得非常重要,尤其是寻找一种具有广谱抗性的天然、高效、安全的细菌素已迫在眉睫。本实验的目的就是,寻找一种能够产生广谱抑菌活性的乳酸菌细菌素产生菌,并对该生产菌株进行分离鉴定,同时对它产生的细菌素进行一系列研究。主要研究内容如下:1.从海参肠道中分离到一株有抑菌活性的乳酸菌,经16S rDNA基因序列的分析,初步认定该菌株为植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum),将其命名为植物乳杆菌HS-R9,由它产生的细菌素命名为植物乳杆菌素HS-R9。利用PCR技术,根据NCBI数据库中其它植物乳杆菌素的部分结构基因为模板设计引物,进一步对菌株HS-R9基因组进行扩增;扩增后的基因片段经测序后,通过NCBI比对分析,证实菌株HS-R9基因组含有编码植物乳杆菌素Plantaricin EF的结构基因。2.实验验证了菌株HS-R9发酵液具有广谱抑菌活性。对其发酵过程进行研究,结果显示,0~16 h为对数生长期,16~48小时达到稳定期,48小时后进入衰亡期。整个过程不断的产酸,pH逐渐降低,最后稳定在3.5左右。在对数生长期后期抑菌活性逐渐增强,40~48小时达到最强。3.分别用萃取法、硫酸铵法和超滤法提取菌株HS-R9发酵上清液中的抑菌活性物质,结果表明萃取法效果最佳。通过Tricine-SDS-PAGE电泳分析发现,该发酵提取物的分子量约为3.3 kDa。对其生物学特性分析表明,菌株HS-R9所产的活性物质在温度4~100℃范围内,抑菌活性保持率在70%以上;pH在3~11范围处理后,抑菌活性保持率在80%以上。4.通过有机溶剂乙酸乙酯对菌株HS-R9发酵上清液进行反复萃取得到粗提物,再经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20和葡聚糖凝胶Sephadex G-50层析分离和纯化,收集各个洗脱组分,浓缩后进行HPLC分析,最后得到一个洗脱单峰。经分析,该组分对单核增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌有明显的抑制作用。5.实验进一步比较了菌株HS-R9所产的植物乳杆菌素HS-R9与商业化应用的细菌素Nisin的抑菌活性。结果发现该植物乳杆菌素的抑菌活性明显高于Nisin,其中HS-R9对副溶血性弧菌的抑制作用是Nisin的1.71倍,对单核增生李斯特氏菌的抑制作用是Nisin的2.85倍,这说明菌株HS-R9产的植物乳杆菌素抑菌活性高且抑菌谱广。因此,它在食品工业中具有潜在的应用价值。