一、概述内皮细胞是组织血管的组成成分,担任了调节营养物质运输以及激活血液中细胞和分子物质的多项生物学潜能。内皮细胞能起着控制血管功能的作用,是血管疾病最初也是最关键的防御。由于血管疾病病因同时涉及了遗传因素和表观遗传学因素,找到一个最小副作用的最优的治疗靶点是一个巨大的挑战。作为表观遗传学的重要组成成分,DNA甲基化的改变在有血管疾病的病人和动物体内很常见。近来研究表明DNA甲基化可以作为反映环境对不同种类的细胞影响的“印记”。这种DNA甲基化印记可以被一个甲基化-CpG结合域(MBD)的保守家族所“阅读”。这个保守家族包括MBD1,MBD2,MBD3,MBD4和MeCP2五个成员。它们与其他一些蛋白一起影响着DNA甲基化引起的转录抑制和(或)异染色质的形成。因此,他们影响着表观遗传基因组的生成,维持和相互作用。每个MBD家族成员可以以它与甲基化DNA结合的亲和力来区分,其中亲和力最强的是MBD2,而MBD3则不能结合甲基化的DNA。除了MBD3外,MeCP2, MBD1,MBD2和MBD4缺陷的小鼠都可以存活。其中MBD2缺陷的小鼠除了雌性小鼠会有哺乳行为的缺陷外,显示儿乎完全正常的表型,表明MBD2有极大可能性作为表观遗传学治疗的优良靶点。我们想检测MBD2在内肢细胞中的作用。我们设想,作为一个关键的表观遗传学调节因子,MBD2能够改变内皮细胞特异性基因的表达,并且在内皮细胞功能紊乱和血管生成方面起调节作用。我们发现抑制MBD2的表达可以显著地增强血管生成,抑制双氧水引起的内皮细胞凋亡。MBD2基因缺陷小鼠显著改善下肢缺血之后的血流恢复。考虑到生理状态下MBD2基因缺陷小鼠几乎正常的表型,我们的结果表明MBD2有潜力作为治疗和预防内皮细胞损伤的靶点。二、MBD2表达降低能保护双氧水诱导的内皮细胞凋亡并促进血管生成我们首先用MBD2干扰RNA或对照干扰RNA转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC),检测降低MBD2表达对内皮细胞功能的影响。Western blot检测到人脐静脉内皮细胞表达MBD2,并且检测到MBD2干扰RNA转染后能剂量依赖性地抑制MBD2的表达。当用100 nmol/l的MBD2干扰RNA转染脐静脉内皮细胞后,MBD2的表达几乎被完全抑制。然后我们将干扰RNA转染后的脐静脉内皮细胞种到减生长囚子martigel预处理过的培养板。MBD2表达降低后明显增强了内皮细胞在减生长因子matrigel里成管的形成。我们于培养4小时后即可观察到MBD2干扰RNA转染后的内皮细胞有管状的形成,而对照干扰RNA转染后的细胞此时还没有明湿的管状形成。转染24小时后,MBD2干扰RNA转染后的细胞成管数量在单位面积里明显超过对照RNA转染的内皮细胞成管数量。为检测MBD2对内皮细胞增殖的影响,转染后的细胞用氚三标记包嘧啶法进行了增殖实验。我们于16小时后发现MBD2干扰RNA转染后的细胞增殖明显比对照RNA转染后的细胞快。接着我们又检测了MBD2干扰RNA转染对细胞凋亡的影响,在RNA干扰后24小时后,我们用0.2mM的双氧水又孵育了24小时。我们发现MBD2干扰RNA转染后降低了双氧水引起的内皮细胞凋亡。这些都表明了MBD2负调节血管生成并能促进双氧水诱导的内皮细胞凋亡。三、MBD2基因缺陷小鼠较正常小鼠显著促进后肢缺血后的恢复临床上心血管疾病病人预后不佳与其对缺血反应的血管生成能力低下有关。鉴于我们观察到MBD2基因负调节内皮细胞血管生成,我们检测了它在缺血损伤后对血流灌注的影响。我们首先验证了MBD2敲除小鼠的血管中MBD2蛋白表达降低。接着,我们给野生型小鼠做了股动脉结扎摘除术使之下肢缺血.并在不同的缺血时间后检测MBD2蛋白的表达是否有改变。在生理状态下,只能检测到较低水平的MBD2.但是在缺血发生后,MBD2蛋白水平增加了,并且在缺血后第四天左右达到最高,之后MBD2水平又慢慢回落且在术后14天左右回到相对低的水平。免疫染色显示MBD2表达主要在血管上并且主要在内皮细胞上(与CD31表达大部分重合)。下肢缺血后的免疫染色显示MBD2表达增高同时伴随着CD31表达也增高,说明内皮细胞在缺血后的成管能力可能与MBD2表达水平相关。为了确定MBD2基因在缺血后血流恢复中的作用,我们对MBD2敲除小鼠和对照小鼠进行了单侧后肢缺血手术。手术后所有小鼠都存活了。术前和术后我们用激光多普勒探测缺血侧和非缺血侧下肢的血流灌注情况。MBD2敲除小鼠在术后第2天就有小部分的血流回复,术后第七天就恢复到了50%,术后第14天几乎完全恢复。但是野生型小鼠直到第4天才有小部分的血流恢复,术后第7天才恢复了30%左右,术后第14天才恢复了60%左右。为检测新生血管的差别,我们检测了毛细血管(CD31阳性细胞)和小动脉(平滑肌α-actin阳性细胞)形成。我们发现MBD2敲除小鼠的切片中CD31阳性细胞和平滑肌α-actin阳性细胞较对照组增多。总的来说,我们的结果显示MBD2表达降低可以促进缺血后毛细血管生成和小动脉血管生成进一步促进缺血后血流灌注的恢复。四、抑制MBD2表达可以激活内皮细胞生存和促血管生成信号通路我们接着检测了两个最主要的内皮细胞生存信号通路：ERK和AKT。我们用MBD2特异性siRNA或者对照的siRNA转染人脐静脉内皮细胞降低MBD2表达水平,然后检测两组细胞磷酸化的ERK和AKT水平。我们发现转染后两组细胞磷酸化AKT水平并无明显改变,但是转染后MBD2组磷酸化ERK表达水平较对照组显著增高。鉴于磷酸化ERK能稳定BCL-2,而BCL-2是一个抗凋亡的蛋白,我们又检测了双氧水处理之后两组BCL-2表达水平,结果发现MBD siRNA转染组BCL-2表达水平增高。进一步,我们检测了MBD2敲除小鼠和正常小鼠中磷酸化ERK和BCL-2等表达,得到相似的结论。令人惊奇的是,MBD2表达降低后并不影响抗氧化应激的两个主要酶：MnSOD和Cu/Zn SOD的表达。为找寻MBD2负调节血管生成的机制,我们检测了两大关键因子eNOS和VEGF-R2的表达。我们发现MBD2 siRNA转染人脐静脉内皮细胞后增加了内皮细胞磷酸化eNOS,总eNOS以及VEGF-R2表达水平。MBD2敲除小鼠以及对照小鼠的血管也显示了类似的结果。我们还进一步检测了p38 MAPK的表达,发现MBD2 siRNA组和MBD2敲除小鼠血管中磷酸化p38显著增高。总的来说,抑制MBD2表达很可能是通过激活细胞生存和促血管生成信号通路来增强内皮细胞生存和促血管生成。五、eNOS协同VEGF-R2促进内皮细胞生存和血管生成为了闸述上述信号分子之间的联系,我们使用VEGF-R2或eNOS的抑制剂来处理内皮细胞观察生存和血管生成信号通路的反应。VEGF刺激不影响总VEGF-R2、总eNOS和总ERK1/2的表达,但能促进VEGF-R2、eNOS和ERK1/2的活化并增强Bcl-2的表达。和预想的一样,VEGF-R2中和抗体或者化学抑制剂(SU1498)抑制了VEGF引起的VEGF-R2、ERK1/2和BCL-2活化。eNOS的活化也被中度抑制。而用eNOS抑制剂L-NAME处理内皮细胞再用VEGF处理后,不仅磷酸化eNOS活化降低,同时VEGF-R2、ERK1/2和BCL-2活化也显著降低。这些结果表明ERK1/2和BCL-2是eNOS和VEGF-R2的下游,并且eNOS协同VEGF-R2一起增强内皮细胞生存和血管生成通路。为进一步证实上述结论,接下来我们在下肢缺血.手术后MBD2敲除小鼠和对照小鼠的饮水中放入或不放入L-NAME并观察四组小鼠术后血流恢复情况。给予L-NAME后MBD2敲除小鼠和正常小鼠血流恢复无明显差别,说明L-NAME能消除MBD2基因缺陷引起的血流恢复变化。六、MBD2可以结合到eNOS和VEGF-R2启动子区的高GC含量区域上述结果中MBD2表达降低增高了eNOS和VEGF-R2的表达,而且以往的研究也表明甲基化对eNOS和VEGF-R2的表达有作用,促使我们去探索MBD2是不是直接结合到eNOS和VEGF-R2启动子区从而抑制了它们的表达。虽然在eNOS启动子区没有明显的CpG岛,但我们发现在5’非编码区有一个GC富含区域。相对而言,我们在VEGF-R2启动子区发现了两个典型的CpG。接着,我们用染色体免疫共沉淀法获得了MBD2-DNA复合物。然后我们针对eNOS启动子区5’非编码区设计了覆盖全长的多对引物,针对VEGF-R2的两个CpG岛设计了三对引物,并且这些引物去扩增MBD2结合的DNA片段。覆盖eNOS启动子区的8对引物都没有得到扩增产物,而覆盖eNOS的5’端非编码区的两对引物得到了阳性扩增产物。另人惊讶的是,针对VEGF-R2的CpG岛设计的三对引物中,只有覆盖-64到+167区域的第三对引物得到了扩增产物。为进一步证实我们的推论,我们首先用对照siRNA或MBD2 siRNA转染HUVEC 24小时,然后再用5-azadc (DNA甲基化酶抑制剂)处理细胞24小时,检测eNOS和VEGF-R2的表达。我们发现5-azadc处理后,MBD2表达降低带来的eNOS和VEGF-R2增高效应被抑制了,说明这其中有甲基化的参与。接着,我们用染色体免疫共沉淀法获得了MBD2-DNA复合物。然后我们针对eNOS启动子区/5’非翻译区设计了覆盖全长的多对引物,针对VEGF-R2的两个CpG岛设计了三对引物,并用这些引物去扩增MBD2结合的DNA片段。覆盖eNOS启动子区的8对引物都没有得到扩增产物,而覆盖eNOS的5’端非翻译区的两对引物得到了阳性扩增产物。令人惊讶的是,针对VEGF-R2的CpG岛设计的三对引物中,只有覆盖-64到+167区域的第三对引物得到了扩增产物。为进一步证实上述CHIP结果,我们特别用bisulfite DNA测序方法检测了eNOS 5’端区域的13个CpG位点的甲基化情况。我们发现在生理情况下,eNOS5’端区域的13个CpG位点存在甲基化,并且在模拟缺血(缺氧加血清饥饿)刺激下,内皮细胞DNA总体甲基化程度增高。我们接着又做了EMSA实验来证明MBD2能够结合到eNOS的这个区域的甲基化CpG上。生物素标记的PCR产物(+31 to +197)首先取一部分被SssI甲基化酶处理,然后我们用经甲基化酶处理或者未经甲基化酶处理的PCR产物作为探针去检测MBD2的结合活性。我们发现MBD2可以结合到那些甲基化过后的PCR产物,并且亲和力很高。为进一步论证MBD2结合到那些甲基化后的CpG元件后,抑制了eNOS的转录活性,我们将eNOS启动子区(-1700到+350)克隆进pGL-2载体(pGL-eNOS)我们还构建了一个突变的eNOS启动子报告载体(pGL-eNOSm),在构建的时候,-200到+300这一段区域CpG中的C都突变为A。接着我们将pcDNA-MBD2载体、pGL-TK载体和pGL-eNOS载体或者pcDNA-MBD2载体、pGL-TK载体和pGL-eNOSm载体分别共转HUVEC细胞做荧光报告基因检测。我们的结果显示只有甲基化后的载体报告子显示有荧光活性的差异,表现在CpG元件缺失后报告荧光的活性增加近一倍。相对而言,在没有被甲基化的情况下,pGL-eNOS载体和pGL-eNOSm载体的报告荧光活性没有显著差异。这些结果都表明了MBD2直接结合到eNOS和VEGF-R2的启动子区域的CpG元件上,并抑制了它们的转录水平。七、MBD2对eNOS转录过程的抑制只限于内皮细胞,并且这个过程中涉及了染色体重构。有报导表明MBD2介导的转录抑制与HDACs引起的染色体重构有关。为了检测MBD2对eNOS转录的抑制是否也涉及了染色体重构,我们在MBD2特异性siRNA和对照siRNA转染后的内皮细胞的培养基中加入TSA。TSA是组氨酸去乙酰化酶(HDAC)的抑制剂,但是在内皮细胞中加入TSA会引起eNOS表达的降低。另人惊讶的是,加入TSA后MBD2特异性siRNA转染组和对照siRNA转染组eNOS的表达变得没有明显差别了,说明TSA处理消除了MBD2特异性siRNA增强eNOS表达的作用。TSA处理在非内皮细胞中能诱发eNOS表达,而降低MBD2表达在内皮细胞能引起eNOS表达增加,促使我们去研究MBD2表达降低对非内皮细胞eNOS表达的作用。我们将MBD2特异性siRNA和对照siRNA转染Hela细胞,并在转染后的Hela细胞中加入TSA或DMSO(对照溶剂)后检测eNOS的表达。令人惊讶的是,要Hela细胞中TSA能诱发eNOS表达,而在Hela细胞中降低MBD2蛋白表达并没有诱发eNOS表达。我们用HEK293细胞也得到了相似的结论。接着我们将MBD2敲除小鼠和对照小鼠的脾细胞分离出来,并用TSA或者DMSO(对照溶剂)处理,检测eNOS表达,发现TSA处理可以诱发脾细胞表达eNOS,而DMSO处理的MBD2敲除小鼠和对照小鼠的脾细胞都不表达eNOS。从以上结果,我们得出了这样一个结论,MBD2对eNOS转录抑制仅限于内皮细胞,且此过程涉及了HDACs和染色体重构。八、结论1.我们研究证明MBD2在下肢缺血后的血流恢复中起重要作用2.MBD2表达降低能保护双氧水诱导的内皮细胞凋亡并促进血管生成3.抑制MBD2表达可以激活内皮细胞生存和促血管生成信号通路4.MBD2可以结合到eNOS和VEGF-R2启动子区的高GC含量区域5.MBD2对eNOS转录过程的抑制只限于内皮细胞,并且这个过程中涉及了染色体重构。综上所述,MBD2通过结合到eNOS启动子附近的5’非编码区和VEGF-R2启动子区,抑制eNOS和VEGF-R2的表达,从而负调节血管生成和内皮细胞功能。敲除MBD2基因的小鼠相对对照小鼠能促进下肢缺血后的血流恢复以及糖尿病诱导的内皮细胞损伤。