论文部分内容阅读
AtPHR1/OsPHR2是植物缺磷胁迫响应中心调控转录因子,参与大部分缺磷响应基因诱导表达。遗传学上已表明水稻只包含SPX结构域的SPX1是PHR2的抑制子,但SPX蛋白如何负调控PHR2功能的机制尚不清楚。水稻有六个只包含SPX结构域基因。其中SPX1和SPX2细胞核特异定位。我们研究发现SPX1和SPX2的表达水平缺磷诱导受PHR2直接调控,提示SPX1和SPX2蛋白参与负反馈调控PHR2功能。突变体材料水培生理实验显示,充分供磷(200μLM Pi)条件下Spx1、spx2和spx1/spx2突变体植株磷浓度显著高于野生型。spx1/spx2双突变体由于严重磷积累造成老叶叶尖出现坏死早衰和植株生长抑制。33P吸收实验表明,spx1、spx2和spx1/spx2突变体磷吸收能力和磷从根往地上部转运能力增加。对突变体材料里PHR2下游缺磷响应基因表达分析表明,IPs1、miR399、miR827、PT2、SQD2和PAP10基因在Spx1/spx2双突材料里都显著诱导表达,但spxl单突变体诱导表达IPS1、miR399和PT2,而spx2单突变体只诱导表达PT2。缺磷不同时间点磷信号分析表明,Spx1、spx2和Spx1/spx2突变体材料对缺磷信号超敏。我们分析SPX1与SPX2超表达材料发现SPX1和SPX2超表达延缓PHR2下游缺磷响应基因诱导表达。SPX1和SPX2相关突变体和超表达材料分析结果显示,SPX1和SPX2负反馈调控PHR2功能,且存在部分功能冗余。通过原位杂交和SPX1-GUS/SPX2-GUS融合蛋白组织化学分析表明,SPAT1和SPX2都在叶片的叶肉细胞和维管束及侧根除表皮外的其它组织表达。但是它们在主根表达部位有所区别:SPX1主要在主根表皮、外皮层、厚壁组织和中柱表达,皮层有微弱表达;SPX2主要在主根外皮层和厚壁组织表达。SPX1和SPX2相似组织表达部位与其具有功能冗余一致。SPX1和SPX2截短蛋白亚细胞定位分析表明,SPX结构域决定SPX1和SPX2的细胞核特异定位,暗示SPX1和SPX2行使功能需要SPX结构域。已报道SPX结构域都是通过蛋白互作发挥作用。蛋白免疫共沉淀实验表明,在供磷和缺磷条件SPX1和SPX2都通过SPX结构域与PHR2蛋白互作。PHR2截短蛋白分析显示,SPX1和SPX2与PHR2蛋白负责结合P1BS元件的C端互作。双分子荧光互补实验不仅确认蛋白免疫共沉淀实验结果,而且表明SPX1、SPX2及其SPX结构域与PHR2或PHR2的C端截短蛋白在细胞核里形成蛋白复合体。烟草双荧光瞬时表达实验显示,超表达SPx1、SPX2或包含完整SPX结构域的N端蛋白区段(SPX1-N195和SPX2-N191)能显著抑制PHR2转录4×P1BS启动子驱动的LUC (firefly luciferase)报告基因表达。进一步体内染色体免疫共沉淀实验表明,SPX1和SPX2通过蛋白互作抑制PHR2结合P1BS,且SPX结构域完全可以行使抑制功能。体内染色体免疫共沉淀实验也表明SPX1和SPX2抑制PHR2结合下游不同基因启动子能力存在差异。分析SPX1和SPX2与PHR2相关遗传材料磷浓度和磷信号表明,SPX1、SPX2或SPX结构域(SPX1-N195和SPX2-N191)超表达可以回复PHR2超表达引起的磷积累和缺磷响应基因诱导表达。反之,phr2突变体可以回复spx1和spx2突变造成的磷积累和缺磷响应基因诱导表达。结果证明SPX1和SPX2与PHR2遗传互作,同时也在遗传学上证明SPX1和SPX2行使负调控PHR2功能依赖一段包含完整SPX结构域的N端蛋白区段。pt2突变体回复spx1和spx2突变体磷浓度升高表型,表明spx1和spx2磷浓度升高主要依赖PHR2介导的PT2诱导表达。这与已报导的pt2突变可以回复PHR2超表达引起地上部磷积累的结果一致。综上所述,本研究揭示SPX结构域蛋白负反馈调控水稻磷信号和磷平衡中心转录因子PHR2功能机制,而且含完整SPX结构域的N端蛋白区段足够发挥SPX1/2全长蛋白功能。这种负反馈调控机制使植物在环境缺磷胁迫下激发相关信号途径,提高磷吸收、转运能力及生理代谢变化以增加磷吸收与利用的同时,又不快速受到严重缺磷信号而激发限制植物生长发育的间接应急反应。本研究发现对植物适应逆境分子调控机制提供新的知识。