背景:脓毒症是机体对感染的反应失调而导致危及生命的多器官功能障碍。虽然目前针对脓毒症有一些治疗措施,但脓毒症和脓毒症休克仍是导致危重症患者死亡的首要原因。心肌损伤是脓毒症的常见并发症,会导致左室和右室泵功能衰竭。然而,关于脓毒症心肌损伤的潜在分子机制尚未完全清楚。本课题组已发表的结果证实:吸入2%氢气能够有效改善脓毒症小鼠的存活率和器官功能,已研究的脓毒症器官损伤包括肺、肠,而针对氢气是否能有效改善脓毒症小鼠的心脏功能的研究还很少。线粒体功能障碍已被证明是导致重度脓毒症患者死亡的主要原因之一。线粒体具有许多重要的生物学功能,在机体的多种病理生理过程中具有重要作用。近年来多项研究发现线粒体动力学改变在脓毒症和器官损伤的病理过程中具有重要作用,在疾病早期即可发生变化,且与疾病预后具有明显的相关性。因此,从线粒体动力学角度探讨氢气治疗脓毒症心肌损伤的具体机制具有重要科学意义。且以前的研究认为氢气的治疗效应与激活Nrf2/HO-1通路密切相关,但具体机制尚不清楚。线粒体动力学(融合/分裂)平衡是维持线粒体形态和功能的关键因素,其平衡紊乱是脓毒症发病机制的重要环节,可能与Nrf2/HO-1有关。因此,本课题假设:氢气通过激活Nrf2/HO-1通路调控线粒体动力学平衡,发挥对脓毒症小鼠心脏功能的保护作用。本研究拟利用野生型和Nrf2基因敲除型小鼠,采用脐静脉内皮细胞模型和脓毒症动物模型,通过检测线粒体融合/分裂、自噬和生物合成的相关分子表达,线粒体形态和功能,从线粒体动力学角度阐明氢气治疗脓毒症的具体机制,进一步探讨Nrf2/HO-1在此过程中的作用,明确氢气通过激活Nrf2/HO-1通路调控线粒体动力学平衡发挥对脓毒症的保护作用,为氢气治疗脓毒症提供理论依据,为其临床应用奠定基础。实验一:从线粒体动力学角度探讨氢气治疗脓毒症心肌损伤的具体机制目的:评价氢气对脓毒症小鼠存活率、心脏功能、心肌细胞损伤、线粒体动力学及功能的影响,并检测脓毒症小鼠吸入氢气治疗后心肌细胞线粒体功能相关分子表达的变化。方法:雄性ICR小鼠128只,6周龄,体重20～25 g,采用随机数字表法,将其分为4组(n=32):假手术组(Sham组)、假手术+氢气组(Sham+H2组)、脓毒症组(CLP组)和脓毒症+氢气组(CLP+H2组)。采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症模型,于术后1、6h时Sham+H2组和CLP+H2组分别吸入2%氢气1h。观察各组小鼠不同时间点(1、2、3、5、7天)的生存率。术后1d时采集小鼠超声心动数据和心肌组织病理学评分,然后取心脏组织,提取心肌细胞线粒体,采用Clark氧电极法,检测心脏线粒体呼吸控制率,采用萤光素酶法检测线粒体ATP含量,并检测线粒体膜电位;另外取心脏组织,采用Western blot法测定Drp1、Mfn2、LC3、PGC-1α 的表达。结果:与Sham组比较,CLP组和CLP+H2组生存率、心功能、心脏组织线粒体RCR、ATP含量和MMP降低,病理学评分、Drp1、LC3、PGC-1α蛋白表达水平升高(P<0.05),Mfn2蛋白表达水平降低;与Sepsis组比较,Sepsis+H2组生存率升高、心功能改善、病理学评分降低、心脏组织线粒体RCR、ATP含量及MMP升高,Drp1表达水平下降(P<0.05),Mfn2蛋白表达水平升高,PGC-1α、LC3表达水平进一步升高。结论:吸入氢气治疗可以提高脓毒症小鼠的生存率并减轻脓毒症小鼠心肌损伤,其机制与改善线粒体功能和下调线粒体分裂调节因子Drp1的表达及上调Mfn2、PGC-1α、LC3蛋白表达水平有关。实验二:从细胞水平探讨线粒体动力学在氢气治疗脓毒症中的作用目的:观察氢气对脂多糖(LPS)处理的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)线粒体功能及相关蛋白Drp1、LC3的表达的影响。方法:离体培养HUVECs,随机分为4组:正常对照组(sham组);氢气组(H2组);脂多糖组(LPS组);脂多糖+氢气组(LPS+H2组)。sham组不做任何处理,LPS组和LPS+H2组用10ug/ml的LPS处理,同时H2组和LPS+H2组使用0.6mmol/L饱和氢气培养基。分别于LPS处理后2、8、24h,用MTT法测定细胞增殖活性,使用ATP含量测定试剂盒测定4组细胞的ATP含量,用JC-1探针孵育,激光共聚焦显微镜测定4组细胞的线粒体膜电位,用Mito Traker Orange进行线粒体染色,使用激光共聚焦显微镜观察各组细胞线粒体形态,提取细胞蛋白,用Western Blot法测定Drp1和LC3的表达。结果:MTT测定结果显示:与sham组比较,LPS组各时点细胞增殖活性、ATP含量、膜电位均下降(P<0.05),与LPS组比较,LPS+H2组各时间点细胞增殖活性均升高(P<0.05)。线粒体形态测定结果为:与sham组相比,LPS组线粒体长度明显缩短(P<0.05),与LPS组相比,LPS+H2组线粒体长度较LPS组长(P<0.05)。Western Blot结果显示:与sham组比较,LPS组的Drp1和LC3表达在2、8、24h均明显增加(P<0.05),8h变化最明显,与LPS组相比,LPS +H2组的Drp1表达在2、8、24h均明显下降(P<0.05),而LC3的表达则进一步增高。结论:氢气可改善LPS所致的HUVECs线粒体功能损伤,其机制可能与下调Drp1表达和上调LC3表达有关。实验三:探讨Nrf2/HO-1通路在线粒体介导氢气治疗脓毒症中的作用目的:观察野生型小鼠脓毒症模型腹腔注射HO-1抑制剂后,脐静脉内皮细胞经HO-1抑制剂处理后及Nrf2基因敲除小鼠建立脓毒症模型后线粒体功能的改变及线粒体相关分子表达的变化。方法:第一部分:ICR小鼠16只,随机分为2组(n=8):脓毒症组(WT/CLP)和脓毒症+H2吸入组(WT/CLP+H2),Nrf2基因敲除小鼠(KO小鼠)16只,随机分为2组(n=8):基因敲除脓毒症组(KO/CLP)和基因敲除脓毒症+H2吸入组(KO/CLP+H2)。采用盲肠结扎穿孔法建立小鼠脓毒症模型,于术后1、6h时WT/CLP+H2组和KO/CLP+H2组分别吸入2%氢气1 h,其余两组吸入空气。两个部分的实验动物分别于术后一天处死后取心脏组织,提取线粒体做线粒体功能检测:呼吸控制率、ATP含量和膜电位,并用Westernblot法检测线粒体功能相关蛋白Drp1、Mfn2、LC3、PGC-1α的表达。第二部分:成年雄性ICR小鼠32只,6周龄,体重20～25 g,随机分为4组(n= 8):脓毒症组(CLP),脓毒症+H2吸入组(CLP+H2),脓毒症+ZNPPIX组(CLP+ZNPPIX),脓毒症+H2 吸入+ZNPPIX 组(CLP+H2+ZNPPIX)。采用盲肠结扎穿孔法建立小鼠脓毒症模型,于术后1、6h时CLP+H2组和CLP +H2+ZNPPIX组分别吸入2%氢气1h,其余两组吸入空气。CLP+ZNPPIX组和CLP+H2+ZNPPIX组在术前1小时腹腔注射ZNPPIX (40mg/kg)。第三部分:离体培养HUVECs,随机分为4组:脂多糖组(LPS组);脂多糖+氢气组(LPS+H2组);脂多糖+ZNPPIX组(LPS+ZNPPIX组);脂多糖+氢气+ZNPPIX 组(LPS+H2+ZNPPIX 组)。4 组均用 10ug/ml 的 LPS 处理,同时 LPS +H2组和LPS+H2+ZNPPIX组使用0.6mmol/L饱和氢气培养基。LPS+ZNPPIX组和LPS+H2+ZNPPIX组用ZNPPIX处理。分别于LPS处理后8h,使用ATP含量测定试剂盒测定4组细胞的ATP含量,用JC-1探针孵育,激光共聚焦显微镜测定4组细胞的线粒体膜电位,用Mito Traker Orange进行线粒体染色,使用激光共聚焦显微镜观察各组细胞线粒体形态,提取细胞蛋白,用Western Blot法测定Drp1和LC3的表达。结果:第一部分:与WT/CLP组比较,WT/CLP+H2组线粒体RCR、ATP含量及MMP升高,Drp1表达水平下降,HO-1、Mfn2、PGC-1α、LC3表达水平升高(P<0.05),而与WT/CLP组比较,KO/CLP组RCR、ATP含量及MMP进一步下降,且Drp1表达增高,HO-1、Mfn2、LC3、PGC-1α 的表达减少(P<0.05),KO/CLP+H2组各指标结果与WT/CLP组相比无显著差异(P>0.05);与WT/CLP+H2组比较,KO/CLP组RCR、ATP含量及MMP下降,且Drp1表达增高,HO-1、Mfn2、LC3、PGC-1α 的表达减少(P<0.05),KO/CLP+H2 组 Drp1 的表达升高,HO-1、Mfn2、LC3 和 PGC-1α 的表达降低(P<0.05)。第二部分:与CLP组比较,CLP+H2组心脏组织线粒体RCR、ATP含量和MMP升高,Drp1蛋白表达水平降低,HO-1、Mfn2、LC3、PGC-1α蛋白表达水平升高(P<0.05),CLP+ZNPPIX组心脏组织线粒体RCR、ATP含量和MMP降低,Drp1蛋白表达水平升高,HO-1、Mfn2、LC3、PGC-1α蛋白表达水平降低(P<0.05),CLP+H2+ZNPPIX组心脏组织线粒体RCR、ATP含量和MMP无明显变化,HO-1、Mfn2、Drp1、LC3、PGC-1α蛋白表达水平无明显变化(P>0.05);与CLP+H2组比较,CLP+ZNPPIX组心脏组织线粒体RCR、ATP含量及MMP降低,Drp1表达水平增加,HO-1、Mfn2、PGC-1α、LC3表达水平降低(P<0.05),CLP+H2+ZNPPIX组心脏组织线粒体RCR、ATP含量及MMP降低(P<0.05),Drp1表达水平增加,HO-1、Mfn2、PGC-1α、LC3表达水平降低(P<0.05)。第三部分:与LPS组比较,LPS+ZNPPIX组线粒体最大呼吸速率、ATP含量、膜电位均下降(P<0.05),而LPS+H2+ZNPPIX组无差异(P>0.05);与LPS+H2组比较,LPS+ZNPPIX组和LPS+H2+ZNPPIX组线粒体最大呼吸速率、ATP含量、膜电位均下降(P<0.05)。线粒体形态测定结果为:与LPS组相比,LPS+ZNPPIX组线粒体长度明显缩短,LPS+H2+ZNPPIX组无明显差异;与LPS+H2组相比,LPS+ZNPPIX组和LPS+H2+ZNPPIX组线粒体长度都缩短。Westernblot结果显示:与LPS组比较,LPS+H2组HO-1、LC3表达增加,而LPS+ZNPPIX 组 HO-1、LC3 表达减少,LPS+H2+ZNPPIX 组 HO-1、LC3 表达水平无改变。与LPS组比较,LPS+H2组Drp1表达减少,而LPS+ZNPPIX组Drp1表达增加,LPS+H2+ZNPPIX组Drp1表达水平无改变;与LPS+H2组相比,LPS+ZNPPIX 组和 LPS+H2+ZNPPIX 组 HO-1、LC3 表达水平降低,Drp1表达水平增加。结论:HO-1抑制剂ZNPPIX逆转了氢气的治疗作用,同时Nrf2基因敲除也使氢气的治疗作用消失,即氢气通过激活Nrf2/HO-1通路介导线粒体功能的改变,从而达到对脓毒症的治疗作用。小结1.吸入2%氢气可以通过改善线粒体功能和调节线粒体动力学减轻小鼠的心肌损伤,改善脓毒症小鼠心脏功能,提高脓毒症小鼠生存率。2.细胞水平的研究同样也证明氢气治疗可以通过改善线粒体功能和调节线粒体动力学提高细胞的增殖活性。3.通过Nrf2基因敲除小鼠及HO-1抑制剂ZNPPIX在小鼠和细胞水平的研究证明氢气通过激活Nrf2/HO-1通路调控线粒体动力学平衡,改善线粒体的形态结构和功能,从而发挥对脓毒症的治疗作用。