第一部分无烟气烟草水提取物的毒性作用研究研究背景众所周知,吸烟有害健康,烟草的危害不容忽视,公共场所禁烟将促使无烟气烟草制品的消费日趋普遍。无烟气烟草制品是一种不经燃烧过程、直接通过口腔或鼻腔吸食消费的烟草制品,产品形式主要有吸鼻烟、含烟(湿鼻烟和干鼻烟)和嚼烟。由于其使用过程中不产生烟雾,因而容易被认为比传统卷烟危害小。但通过对无烟气烟草使用者和吸烟者的比较研究,美国一癌症中心发现前者吸入尼古丁和亚硝胺的量更大,国际癌症中心的研究也表明,前者患有口腔癌、食道癌、胰腺癌、肝癌等的风险比后者大。因此,无烟气烟草对人体的危害性不可低估,有必要进行毒性研究,为毒性评估提供实验依据。研究目的观察无烟气烟草水提取物(Aqueous extract of smokeless tobacco,AEST)对大鼠的毒性作用以及对小鼠的肝毒性作用,为无烟气烟草的毒性作用评估提供试验依据。研究方法1、AEST对大鼠的毒性作用研究160只健康成年SD大鼠按体重随机分四组,每组40只,雌雄各半,组别分别为溶媒对照组(Control group,C组)、低剂量组(Low-dose group,L组)、中剂量组(Median-dose group,M组)和高剂量组(High-dose group,H组)。L组、M组、H组的AEST染毒剂量分别为3.75、7.50、15.00 mg/kg/day,C组灌胃蒸馏水,连续染毒184天。分别于染毒第92天、184天和恢复期结束时(第214天)处理各组实验动物,观察症状和检测指标包括:一般临床体征、血液学指标、血凝指标、血液生化指标、各脏器重量和组织病理学检查。2、AEST对小鼠的肝毒性作用研究30只健康成年雄性C57BL/6小鼠按体重随机分为三组,每组10只,组别分别为溶媒对照组(Control组)、低剂量组(AEST-L组)和高剂量组(AEST-H组)。AEST-L组和AEST-H组染毒剂量分别为5、15 mg/kg/day,Control组灌胃蒸馏水,连续染毒30天。染毒结束后处理各组实验动物,观察和检测指标包括:各组动物血清中ALT和AST浓度、炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18、MCP-1、TNF-α含量的变化,并观察肝组织的病理学变化。3、AEST对小鼠Hepa1-6肝细胞的毒性作用研究200μg/m L和400μg/m L剂量AEST作用于小鼠肝细胞Hepa 1-6 24h后,检测各组细胞的损伤情况和凋亡率表达水平的变化。研究结果1、AEST对大鼠的毒性作用研究(1)与对照组相比较,L组、M组和H组大鼠体重增长幅度均降低(P<0.05),其中M组和H组大鼠体重增长的降低幅度更大。(2)与对照组相比较,AEST染毒第184天,H组大鼠肝功能损伤指标天门冬氨酸氨基转换酶(AST)和总胆红素(TBIL)含量升高(P<0.05)、丙氨酸氨基转换酶(ALT)含量显著升高(P<0.01),肾功能损伤指标尿素(BU)含量升高(P<0.05);H组雄性大鼠白蛋白(ALB)含量升高(P<0.05)、总蛋白质(TP)含量降低(P<0.05);H组雌性大鼠总胆固醇(TCH)含量降低(P<0.05)、肾功能损伤指标肌酐(CREA)含量升高(P<0.05)。(3)与对照组相比较,雄性大鼠M组在染毒第184天、H组在染毒第92天和184天肝脏相对重量均增加(P<0.05),雌性大鼠M组在染毒第92天、L组和M组在染毒第184天肝脏相对重量增加(P<0.05);所有M组和H组大鼠在染毒第184天肾脏相对重量增加(P<0.05);所有H组大鼠在染毒第184天肺脏相对重量增加(P<0.05)。(4)M组和H组大鼠在AEST染毒第92天,食道、胃、肝脏、肺脏、肾脏和脊髓均出现不同程度病理变化;染毒第184天各脏器病理变化例数增加、病变程度增加;至恢复期结束时,较染毒第184天动物的病理变化例数下降、病变程度降低。其中,在染毒第92天,M组大鼠肝脏出现1例轻微炎性细胞浸润、H组出现3例轻微和1例轻度炎性细胞浸润、1例轻微细胞变性;在染毒184天,M组大鼠肝脏出现3例轻微和2例轻度炎性细胞浸润、2例轻微细胞变性,病变程度较92天增加;H组出现4例轻微、2例轻度、2例中度炎性细胞浸润、1例轻微和1例轻度细胞变性,病变程度较92天增加;至染毒恢复期结束时,M组仅观察到轻微炎性细胞浸润和变性各1例,H组观察到轻微和轻度炎性细胞浸润各1例、1例轻微细胞变性,病变程度较染毒184天降低。2、AEST对小鼠的肝毒性作用研究与对照组相比较,AEST-L组和AEST-H组小鼠肝功能损伤指标血清ALT、AST含量均明显升高(P<0.05);与此同时,两组动物肝脏细胞均出现慢性炎细胞浸润、水样变性或坏死的病理变化,亚细胞结构水平可见细胞中出现线粒体肿胀、内质网扩张以及细胞核固缩等病理现象。3、AEST对小鼠Hepa1-6肝细胞的毒性作用研究与对照组相比较,400μg/m L剂量的AEST引起Hepa 1-6细胞的损伤比例和凋亡率水平都明显上升(P<0.05)。结论1、7.50 mg/kg/day以上剂量AEST引起大鼠肝功能损伤指标如AST、ALT、TBIL等和肾功能损伤指标BU、CREA等含量升高,表明AEST对大鼠肝脏和肾脏有损伤作用。2、7.50 mg/kg/day以上剂量AEST引起大鼠肝脏、肾脏和肺脏相对重量增加,其中在染毒第92天、184天均观察到肝脏相对重量增加,在染毒184天观察到肾脏和肺脏相对重量增加。3、7.50 mg/kg/day以上剂量AEST引起大鼠肝脏、肾脏、肺脏、食道和胃出现不同程度的损伤病理变化,其中肝脏组织发生病理变化损伤程度最为严重;毒性作用的可能靶器官为肝脏、肾脏和肺脏等,其中肝脏毒性作用明显。4、5 mg/kg/day以上剂量AEST引起小鼠肝功能损伤指标AST和ALT含量升高,同时肝细胞出现损伤病理变化,表明AEST对小鼠肝脏具有损伤作用。5、400μg/m L剂量AEST促进小鼠肝细胞Hepa 1-6发生凋亡,损伤小鼠肝细胞。第二部分NLRP3炎症小体在无烟气烟草水提取物致肝损伤中的机制研究研究背景公共场所禁烟将促使无烟气烟草制品的使用日趋流行和普遍。肝脏是机体新陈代谢的中心站和重要的解毒器官,无烟气烟草中的尼古丁等有害物质主要通过肝脏代谢,大量尼古丁代谢将给肝脏带来严重负担。第一部分AEST的毒性作用研究结果显示,AEST引起大鼠和小鼠肝功能损伤指标ALT和AST水平显著升高,同时结合肝脏出现明显的炎性细胞浸润、变性和坏死,表明AEST可以引起明显的肝损伤,并且出现了较为明显的炎性损伤症状。多种肝脏疾病的研究结果表明,与疾病相关的慢性肝脏炎症是由于炎症小体的过度、不恰当的激活而造成的。NLRP3炎症小体是与无菌性炎症密切相关的炎症小体,其被激活之后能够使无活性的半胱天冬酶前体(pro-caspase-1)转化成活性caspase-1,后者对白介素1β前体(pro-IL-1β)、白介素18前体(pro-IL-18)等底物进行切割,使其转化成活性形式IL-1β和IL-18,并释放到胞外发挥功能。目前关于无烟气烟草制品对肝脏功能的影响及其相关机制尚不明了。因此,在第二部分研究中将通过在体外实验中采用NLRP3抑制剂和ROS抑制剂进行干扰研究、在体内研究中利用Nlrp3基因敲除小鼠和野生型小鼠对比研究,探索NLRP3炎症小体在无烟气烟草致肝损伤中的作用,并为无烟气烟草致肝损伤性疾病的防治提供实验数据参考和有效帮助。研究目的观察AEST对肝组织产生的损伤作用,探讨NLRP3炎症小体在AEST致肝损伤中的作用及可能机制。研究方法1、体外细胞研究AEST作用于Hepa 1-6细胞后,检测细胞损伤情况、凋亡率和ROS表达水平、NLRP3炎症小体相关的Nlrp3和pro-IL-1βm RNA水平、胞外IL-1β、IL-18蛋白表达水平、NLRP3炎症小体相关的NLRP3、pro-Caspase-1、pro-IL-1β、Caspase-1 p10蛋白表达水平的变化;观测NLRP3抑制剂Gly联合AEST作用于Hepa 1-6细胞后,上述检测指标表达水平的变化;观测ROS抑制剂APDC联合AEST作用于Hepa 1-6细胞后,上述检测指标表达水平的变化。2、体内试验研究利用TALEN靶向基因敲除技术制备Nlrp3基因敲除小鼠(Nlrp3-/-小鼠),以C57BL/6小鼠为野生型对照小鼠(WT小鼠)。20只雄性Nlrp3-/-小鼠随机分为对照组(Nlrp3-/--Con)和AEST组(Nlrp3-/--AEST),每组10只;20只雄性WT小鼠随机分为对照组(WT-Con)和AEST组(WT-AEST),每组10只。15 mg/kg/day剂量AEST连续经口灌胃30天后,检测各组动物血清ALT和AST含量的变化,观察肝组织的病理学变化,检测NLRP3炎症小体相关的Nlrp3、pro-IL-1βm RNA水平、血清IL-1β、IL-18蛋白表达水平的变化,以及NLRP3炎症小体相关的NLRP3、pro-Caspase-1、pro-IL-1β、Caspase-1 p10蛋白表达水平的变化。研究结果1、AEST激活小鼠肝细胞中的NLRP3炎症小体(1)体外细胞研究结果表明,与对照组相比较,400μg/m L浓度的AEST引起Hepa 1-6细胞中NLRP3炎症小体相关的Nlrp3和pro-IL-1βm RNA水平显著升高(P<0.01);经NLRP3炎症小体激活的IL-1β、IL-18蛋白表达水平显著升高(P<0.01);NLRP3(P<0.05)、pro-Caspase-1(P<0.01)、pro-IL-1β(P<0.01)、Caspase-1p10(P<0.05)四种蛋白表达水平也都有不同程度的升高;同时细胞损伤比例、凋亡率都显著上升(P<0.01)。(2)体内试验研究结果表明,15 mg/kg/day剂量作用下,C57BL/6小鼠肝功能损伤指标血清ALT和AST含量显著升高(P<0.01);肝组织中Nlrp3和pro-IL-1βm RNA水平明显升高(P<0.05);经NLRP3炎症小体激活的血清IL-1β和IL-18蛋白水平明显升高(P<0.05);肝组织中NLRP3、pro-IL-1β、Caspase-1 p10三种蛋白表达水平都有不同程度升高;通过组织病理观察发现,10例WT-AEST组小鼠中4例出现(4/10,40%)出现慢性炎细胞浸润,4例出现(4/10,40%)细胞轻微至轻度变性,尤其是肝小叶中央静脉周围的肝细胞变性比较明显和普遍,3例(3/10,30%)出现细胞轻度至中度坏死,肝小叶中央、中间和周边带坏死均有发生,单灶或多灶性,伴有出血。2、NLRP3抑制剂或Nlrp3基因敲除减轻AEST导致的肝损伤(1)体外细胞研究结果表明,与对照组相比较,NLRP3抑制剂格列本脲(Glyburide,Gly)处理组Hepa 1-6细胞的NLRP3蛋白水平、损伤比例和凋亡率都显著下降(P<0.01);细胞中Nlrp3和pro-IL-1βm RNA、上清IL-1β和IL-18蛋白、以及pro-Caspase-1、pro-IL-1β、Caspase-1 p10三种蛋白表达水平都明显下降(P<0.05)。(2)体内试验研究结果表明,与野生型C57BL/6小鼠相比较,Nlrp3-/-小鼠肝组织中NLRP3炎症小体相关的pro-IL-1βm RNA水平明显下降(P<0.05);经NLRP3炎症小体激活的血清中IL-1β和IL-18蛋白水平明显下降(P<0.05);同时,肝功能损伤指标血清ALT和AST水平明显下降(P<0.05);肝组织中经NLRP3炎症小体激活表达的Caspase-1 p10蛋白水平明显下降(P<0.05);通过组织病理观察发现,Nlrp3-/-小鼠10例动物中2例出现(2/10,20%)出现慢性炎细胞浸润,2例(2/10,20%)出现门静脉血管分支旁的肝细胞淡染呈轻微水样变性,2例(2/10,20%)出现细胞轻度至中度坏死,以中央和中间带坏死为主,经统计肝脏出现病理变化的例数比野生型小鼠有所减少。3、AEST通过产生ROS激活肝细胞NLRP3炎症小体(1)体外细胞研究结果表明,与对照组相比较,400μg/m L浓度的AEST引起Hepa 1-6细胞ROS表达水平显著上升(P<0.01);NLRP3炎症小体相关的Nlrp3和pro-IL-1βm RNA水平显著升高(P<0.01);经NLRP3炎症小体激活的IL-1β、IL-18蛋白的表达水平显著升高(P<0.01);NLRP3(P<0.05)、pro-Caspase-1(P<0.01)、pro-IL-1β(P<0.01)、Caspase-1 p10(P<0.05)四种蛋白表达水平也都有不同程度的升高;同时细胞损伤比例、凋亡率也显著上升(P<0.01)。(2)与AEST组相比较,AEST和ROS抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸铵(Ammonium pyrrolidine dithiocarbamate,APDC)联合处理组Hepa 1-6细胞的ROS表达水平、损伤比例、凋亡率、NLRP3蛋白都显著下降(P<0.01);Nlrp3和pro-IL-1β的m RNA、上清IL-1β和IL-18蛋白、以及pro-Caspase-1、pro-IL-1β、Caspase-1 p10三种蛋白表达水平都明显下降(P<0.05)。结论1、AEST激活肝细胞NLRP3炎症小体。2、NLRP3抑制剂或Nlrp3基因敲除能够减轻由AEST导致的肝损伤。3、AEST通过产生ROS激活肝细胞NLRP3炎症小体的表达。本研究发现AEST能损伤肝组织,并可经由使肝细胞产生ROS激活NLRP3炎症小体导致肝损伤的发生。本课题的完成提示,NLRP3炎症小体在AEST致肝损伤中起到重要作用,并且可为无烟气烟草致肝损伤的防治研究提供科学依据。