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烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide,NMN)是人体内合成NAD+的重要前体,通过转化为NAD+来发挥其生理功能,与多种疾病紧密相关,其中NMN用于治疗衰老性疾病及延缓衰老是其研究最为热门的领域之一。NMN已逐渐应用于保健食品和医学药物,用于预防与治疗代谢性疾病,心脑血管疾病,衰老性疾病等。但由于合成问题,目前以NMN为主要成分的产品价格仍十分昂贵。合成NMN的方法中,相比于化学法合成NMN,生物法因无有机溶剂残留也不存在手性问题,成为最环保无公害的合成方法。但仍然存在一些限制,例如高效率的酶制剂的缺乏,反应底物带来的高昂成本等问题。本研究旨在通过基于生物信息学的酶分子筛选方法,筛选高效合成NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphoribosyl transferase,Nampt,EC 2.4.2.12),该酶是催化烟酰胺(Nicotinamide,NAM)和磷酸核糖焦磷酸(Phosphoribosylpyrophosphate,PRPP)直接合成NMN的酶,在此基础上将该酶初步应用于单酶、多酶联用催化合成NMN。具体研究结果如下:(1)基于生物信息学的酶分子筛选方法挖掘Nampt迄今为止,已被KEGG酶数据库收录的Nampt超过600条,只有来源Homo sapiens,Mus musculus和Rattus norvegicus的Nampt被表征,难以满足合成NMN的需求。本研究以来源Meiothermus ruber和Methanobacterium sp.Pta U1.Bin097的Nampt的氨基酸序列出发,通过NCBI数据库的BLASTP功能筛选Nampt,并将这些来源的Nampt在SWISS-MODEL平台进行同源建模,再使用Discovery Studio软件,采用分子对接手段,通过模拟不同来源的Nampt与底物小分子NAM在结合口袋中的结合,选定对接结果中打分系统-CDOCKER_ENERGY值高的Nampt作为候选酶。在分子对接评分结果中,哺乳动物中-CDOCKER_ENERGY值最高的是来源Homo sapiens的Nampt(h Nampt),细菌中-CDOCKER_ENERGY值最高的是来源Comamonadaceae bacterium的Nampt(c Nampt)和来源Meiothermus ruber的Nampt(c Nampt)。将这三个来源的Nampt作为候选酶。(2)烟酰胺磷酸核糖转移酶的表达与酶学性质分析以上述三个来源的Nampt的基因为研究对象,在大肠杆菌中表达,纯化获得Nampt蛋白。对三个来源的Nampt酶学性质进行分析。以NAM为底物,h Nampt的Km为0.12μmol/L,Vmax为0.11μmo L/(min·mg),kcat为0.05 1/s。m Nampt的Km为0.39μmol/L,Vmax为3.20μmo L/(min·mg),kcat为1.39 1/s。c Nampt的Km为0.14μmol/L,Vmax为3.10μmo L/(min·mg),kcat为1.38 1/s。与已表征的Nampt相比,本文表达的m Nampt和c Nampt的kcat/Km远高于其他来源的Nampt,更适用于工业酶法合成NMN。其中c Nampt的kcat/Km为9.86×106 1/s,是目前已表征的Nampt中最高的。将测定的动力学参数与上述酶分子筛选方法中分子对接结果进行探讨,三个来源的Nampt分子对接结果中-CDOCKER_ENERGY大小排序与测定的酶kcat/Km值的大小排序一致,拟合度高。说明本研究前期的酶分子筛选方法在筛选催化性质好的Nampt效果良好,验证了该筛选方法的可用性。(3)单酶、多酶联用催化合成NMN将来源Comamonadaceae bacterium的Nampt初步进行单酶催化合成NMN,结果显示,单酶法合成NMN中,通过补加一次底物PRPP,10min时NMN产量34mg/L,转化效率为204 mg/(L·h)。通过文献分析酶学性质较好的核糖磷酸焦磷酸激酶(Ribose phosphate pyrophosphokinase,Prs),来源H.sapiens的Prs(h Prs)Km值远高于其他物种,来源Pyrobaculum calidifontis的Prs(pPrs)比酶活测定最高,将这两个来源的Prs在大肠杆菌中表达,纯化,作为双酶法合成NMN中与Nampt联用的酶。其中h Prs成功的可溶性形式表达,pPrs未能以可溶性形式表达。将h Prs和c Nampt联用催化合成NMN,180 min时NMN产量29 mg/L,转化效率为9.67 mg/(L·h)。通过文献分析酶学性质较好的核糖激酶(Ribokinase,Rbks),来源Escherichia coli的Rbks(e Rbks)的底物亲和性是原核来源的Rbks中最好的,来源H.sapiens的Rbks(h Rbks)的底物亲和性是哺乳动物来源的Rbks中最好的,且kcat/Km值是目前表征的Rbks中最高,将这两个来源的Rbks在大肠杆菌中表达,纯化,作为三酶法合成NMN中与Nampt、Prs联用的酶。将e Rbks和h Prs、c Nampt联用催化合成NMN,240min时NMN产量24 mg/L,转化效率为6 mg/(L·h)。将h Rbks和h Prs、c Nampt联用催化合成NMN,180 min时NMN产量24 mg/L,转化效率为8 mg/(L·h)。从单酶到多酶来合成NMN,随着参与反应的酶个数增加,虽然产量有所降低,双酶法降至单酶法的85%,三酶法降至单酶法的71%。但底物总成本也得到大幅度降低,其中双酶法降至单酶法的1%,三酶法降至单酶法的0.4%。