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目的:分选、培养人结肠癌CW-2干细胞;比较3种细胞分选方法对人结肠癌CW-2干细胞的富集效率,探讨获得肿瘤干细胞的有效方法;初步研究人结肠癌CW-2干细胞的生物学特性。方法:采用单纯无血清悬浮培养、无血清悬浮培养+奥沙利铂、无血清悬浮培养+奥沙利铂+流式细胞分选术(多重联合)分别对人结肠癌CW-2干细胞进行分离、培养。然后应用流式细胞术、体内NOD-SCID小鼠致瘤实验和体外Transwell侵袭实验比较3种细胞分选法的富集效率。细胞分化实验、细胞周期检测、体外侵袭实验、体内成瘤实验、移植瘤免疫组化和HE染色对肿瘤干细胞进行生物学特性研究。结果:人结肠癌CW-2细胞在无血清培养液中仅少部分存活并增殖形成悬浮的肿瘤干细胞球;无血清悬浮培养细胞、无血清悬浮培养+奥沙利铂处理细胞和多重联合分选后细胞中具有结肠癌干细胞特性的CD44~+EpCAM~+细胞含量分别为57.39%、73.85%、89.57%;分别测量不同时间点(4、7、9、14、21、28 d)各组小鼠成瘤情况,多重联合分选细胞接种NOD-SCID小鼠后成瘤时间早、瘤体增长速度快,接种后第4、7、9、14、21、28 d体积分别为(209.25±31.54)mm~3、(500.00±72.90)mm~3、(852.75±157.51)mm~3、(2280.00±440.91)mm~3、(4897.00±1154.15)mm~3、(11070.00±3559.86)mm~3,与无血清悬浮培养细胞、无血清悬浮培养+奥沙利铂处理细胞的成瘤能力差异有统计学意义(P<0.05);单纯无血清悬浮培养细胞、无血清悬浮培养+奥沙利铂处理细胞和多重联合分选后细胞接种72h后穿过人工基底膜的细胞数分别为(98±7)个/视野、(135±7)个/视野、(188±6)个/视野,3组之间差异有统计学意义(P<0.05),故3种分选方法所获得细胞中肿瘤干细胞含量由高到低为:多重联合分选后细胞、无血清悬浮培养+奥沙利铂处理细胞、单纯无血清悬浮培养细胞。CD44~+EpCAM~+细胞球在含血清培养液中易分化为贴壁生长的细胞;CD44~+EpCAM~+细胞中G0/G1期细胞占86.19%,G2+S期细胞占13.81%,未分选细胞(传统含血清培养细胞)中G0/G1期细胞占69.34%,G2+S期细胞占30.66%,CD44-EpCAM-细胞中G0/G1期细胞占56.04%,G2+S细胞占43.96%,3群细胞之间差异有统计学意义(P<0.05),CD44~+EpCAM~+细胞处于低增殖状态,未分选细胞处于中等增殖状态,CD44-EpCAM-细胞处于高增殖状态;未分选细胞、多重联合分选后CD44~+EpCAM~+细胞、CD44-EpCAM-细胞接种72h后穿过人工基底膜的细胞数分别为(56±5)个/视野、(188±6)个/视野、(0±0)个/视野,3组之间差异有统计学意义(P<0.05),CD44+EpCAM+细胞比未分选细胞和CD44-EpCAM-细胞更具有侵袭能力;分别测量不同时间点(4、7、14、21、28d)各组小鼠成瘤情况,多重联合分选后CD44~+EpCAM~+细胞接种NOD-SCID小鼠后成瘤时间早、瘤体增长速度快,而未分选细胞接种后成瘤时间相对较晚、瘤体增长速度慢,接种后第4、7、14、21、28d体积分别为(0.00±0.00)mm~3、(0.00±0.00)mm~3、(180.45±86.25)mm~3、(514.36±24.63)mm~3、(1161.75±49.88)mm~3,CD44-EpCAM-细胞接种NOD-SCID小鼠后始终无瘤体形成,3组间差异有统计学意义(P<0.05),CD44~+EpCAM~+细胞成瘤能力强于未分选细胞和CD44-EpCAM-细胞;移植瘤细胞膜上可见CD44和EpCAM的表达,移植瘤具有与人结肠癌相似的病理改变。结论:肿瘤干细胞在无血清培养液中形成悬浮的肿瘤干细胞球。单纯无血清悬浮培养法、无血清悬浮培养+化疗药物法、多重联合法均能获得一定纯度的肿瘤干细胞,而多重联合法富集肿瘤干细胞的效果明显强于单纯无血清悬浮培养和无血清悬浮培养+化疗药物法,是获得肿瘤干细胞较好的方法。CD44~+EpCAM~+肿瘤干细胞是一群具有低增殖性、易分化性、高侵袭性、高致瘤性的细胞群体。