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肝细胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，病因复杂。文献报道，HBV (hepatitis B virus, HBV)病毒感染是导致HCC的主要原因。HBV病毒拥有环状双链的DNA分子结构，含4个开放读码框架(open reading frame, ORF)，分别是X区、C区、P区和S区，分别编码X、C、P、S四种蛋白，HBV病毒所编码的X蛋白决定了HBV病毒的嗜肝性。近期的大量研究表明，内质网应激（Endoplasmic Reticulum stress, ER stress）存在于HBV引起的HCC中，有报道称HBV S启动子的激活是由Ire1‐XBP‐1这条通路所介导的，并且这条通路的激活是受细胞型限制的，在肝细胞中HBV S启动子是可以通过ER应激被激活，但是在成纤维细胞中不起作用。HBV病毒X区所编码的HBx蛋白作为UPR的诱导物，可以激活ATF6、Ire1‐XBP1通路，促进HBV病毒的复制和表达，从而促进肝病进展甚至发展为肝细胞癌。MANF（Mesencephalic Astrocyte‐derived Neurotrophic Factor），又名ARMET (Arginine rich, mutated in early stage of tumors)，在ER应激的情况下可以特异性表达这种蛋白，多种病理条件下可以发挥神经保护作用。本课题组在前期构建的脑缺血模型及多种ER应激的细胞模型中均发现ER应激可诱导MANF蛋白的表达，至于ER应激相关蛋白及MANF蛋白在HCC中的表达情况我们还不清楚。因此，本实验想探究ER应激相关蛋白在HCC中的表达情况及MANF蛋白在HCC的进程中所起的作用以及对肝细胞肝癌细胞的生物学行为的影响。目的：观察HCC组织中ER应激相关基因的表达情况以及了解MANF蛋白对HCC的增殖活性的影响。方法：收集HBV感染的肝癌组织100多例，用免疫组织化学的方法在形态学上观察ER应激相关蛋白的表达及分布；采用RT‐PCR法检测ER应激相关基因的mRNA表达；用Western blot法检测ER应激相关基因蛋白水平的表达情况；利用原位杂交技术对150例病人的组织芯片进行MANF mRNA的检测并用免疫组织化学检测MANF蛋白的表达。对HepG2、HepG2.2.15、SMMC‐7721及表达HBx蛋白的HepG2细胞细胞株分别转染MANF‐FAG、MANF‐siRNA质粒，并用相对应的空质粒作为对照，利用MTT法检测MANF对肝癌细胞增殖的影响。结果：1．GRP78/BIP在肝细胞肝癌中的表达将收集到的临床病人标本，癌组织和癌旁组织经生理盐水清洗表面血迹后分别进行4%多聚甲醛的固定、包埋、切片，用GRP78/BIP的抗体检测GRP78/BIP在癌组织和癌旁组织中的表达。实验结果发现，与癌旁组织相比，癌组织中GRP78/BIP蛋白的表达明显高于癌旁组织。该结果提示，肝癌组织中GRP78/BIP的表达上调。2. GRP78/BIP的核异位表达GRP78/BIP是一个伴侣蛋白，在正常情况下，GRP78/BIP与ER膜结合蛋白相结合，故GRP78/BIP常定位于ER膜或腔。但我们在实验中发现，在一些肝癌细胞中GRP78/BIP出现在胞核内，提示GRP78/BIP在某种状态下可以从胞浆进入胞核。3．CHOP蛋白在HCC胞浆中的表达CHOP是一种在细胞中广泛表达的蛋白，非应激情况下其的表达量很低，应激可诱导CHOP的表达和核内激活。在我们的实验中发现，癌组织中CHOP的表达明显增加，且主要定位于胞浆中。4．UPR通路相关基因在HCC中的表达我们同时检测了UPR通路相关基因IRE1、ATF6、PERK在肝癌组织中的表达，结果发现，IRE1、ATF6、PERK三种蛋白在癌组织中的表达明显高于癌旁组织，提示在HCC中UPR通路可能被激活。5．MANF在HCC中的表达MANF是ER应激敏感蛋白之一，当发生ER应激时，MANF的表达上调。在我们对150例肝癌样本和136例非肿瘤组织对照的检测中发现，MANF在癌组织中的表达明显低于癌旁组织。与此同时，利用原位杂交的方法发现，癌组织中MANF的mRNA水平也低于癌旁组织，该结果提示，在肝癌中MANF的转录是被抑制的。6． MANF的表达与HCC病人五年生存率的关系对上述150例肝癌病人进行随访时发现，肝癌组织中高表达MANF的病人的五年生存率较低表达MANF的病人延长，提示MANF可能有抑制HCC的作用。7． MANF对肝癌细胞的恶性生物学行为的影响对HepG2、HepG2.2.15、SMMC‐7721及稳定表达HBx的HepG2（HepG2‐HBx）细胞株分别转染MANF‐FLAG或MANF‐siRNA质粒，并用相对应的空质粒作为对照。用MTT法检测MANF对肝癌细胞增殖的影响，结果显示MANF具有抑制肝癌细胞增殖的作用。用划痕实验和transwell侵袭实验分析显示：敲低MANF对肝癌细胞迁移和侵袭能力也有抑制作用，提示MANF具有抑制肝癌细胞恶性生物学行为的作用。结论：1.在HCC中有ER应激存在及UPR通路的激活；2. GRP78/BIP和CHOP蛋白在HCC中定位发生异常；3. ER应激敏感蛋白MANF在HCC中的表达下调，其作用可能与抑制肝癌细胞的增殖有关。