杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）是一种广宿主的肠道致病菌,对多种海水鱼类造成严重感染,给世界各地的水产养殖业造成了重大的经济损失,深入了解其致病机制对防治爱德华氏菌病至关重要。目前已经鉴定出多种与E.piscicida致病过程相关的毒力因子,包括三型分泌系统（T3SS）、六型分泌系统（T6SS）、硫酸软骨素酶、溶血素和鞭毛等。这些大多是在病原菌中普遍存在的毒力因子,在E.piscicida中发挥着类似的功能。本课题组通过转座子插入高通量测序（TIS）筛选出大量杀鱼爱德华氏菌EIB202体内感染必需基因,包括一些功能未知基因或尚未报道与毒力有关的基因。这里面多是E.piscicida的新毒力因子或毒力相关调控因子。本课题对这些因子进行鉴定,分析了它们的功能。采用突变株体内生存必需性模式的分析方法（Pattern analysis of conditional essential loci,PACE）,共筛选到89个候选基因。这些基因失活后,细菌在体内定植能力减弱,是潜在的减毒靶点。本课题从这些减毒靶点中选择了保守的假定蛋白ETAE0023作为研究对象。该蛋白属于DcrB蛋白家族,与噬菌体吸附相关,未见与病原菌毒力有关的报道。我们首先通过体内竞争实验验证了 ETAE0023对毒力的影响,发现基因缺失株ΔETAE0023在鱼体内的生存能力明显降低。与已建立的减毒菌株WED和ΔaroC相比,ΔETAE0023在鱼体内被清除得更快,但依然有效激发了宿主免疫反应,尤其是IgM的表达。免疫保护临床试验表明,其免疫保护力高达73.7%。ETAE0023不影响T3SS和T6SS相关蛋白的表达,但是对EIB202侵染鱼类细胞的黏附过程具有重要作用。这些结果表明,ETAE0023是非常有前景的杀鱼爱德华氏菌减毒靶点。在体内感染的必需基因中,ftsH、hfK和hflC的突变都会显著降低EIB202在体内的生存能力,三者分别编码膜蛋白酶FtsH和它的两个调节蛋白HflK和HflC,会在细胞质膜上形成复合物。ftsH在多种肠道病原菌中为生长必需基因,而hflK和hflC尚未发现会对病原菌毒力产生影响,表明三者在杀鱼爱德华氏菌中的功能具有独特性。本课题对FtsH及其调节蛋白在EIB202中的功能进行了分析。通过体内竞争实验,证明了三者的缺失显著降低了 EIB202在体内的定植能力。侵染实验进一步证明,三者对EIB202侵染斑马鱼细胞ZF4的内化过程具有重要作用。ftsH的缺失会增强EIB202在饥饿和高渗透压条件下的生存能力,导致其底物LpxC和YfgM产量的提高,其中LpxC是脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）合成的关键酶。在其他病原菌中,LpxC产量过高会导致菌体损伤,而YfgM则参与了细菌对高渗透压的耐受过程。该研究揭示了 FtsH及其调节蛋白在EIB202中的独特功能。通过水平转移获得的基因岛（Genomic islands,GIs）对细菌的进化起着至关重要的作用,而T3SS和T6SS等赋予细菌致病力的基因岛便是病原菌毒力进化的来源。本课题研究了水平转移的毒力因子EnrR。enrR编码在一个水平转移的基因岛上,存在于多种细菌中,其缺失会显著影响EIB202的毒力,尤其是T3SS和T6SS相关蛋白的表达。EnrR广泛结合并调控EIB202基因组中低G+C含量的GIs区域,通过GI-12中的Cro蛋白调控T3SS和T6SS相关蛋白的表达。作为一个水平转移的调控因子,EnrR调控大肠杆菌（Escherichia coli）原噬菌体的溶原-裂解生活周期转化,还通过激活鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typimurium）毒力岛来增强毒力。EMSA、MST和细菌单杂交等实验手段表明,EnrR具有非特异性结合DNA的能力。实验证实,EnrR是一种核结合蛋白（Nucleoid associated protein,NAP）,第47位精氨酸是其的关键的氨基酸位点。该研究发现了一种新型的具有普适性DNA结合能力的核结合型的GIs调控因子。总之,本课题通过对体内筛选获得的杀鱼爱德华氏菌中3个重点毒力调控因子进行了较为深入的研究,对该菌的毒力调控机制以及疫苗开发提供了理论基础。