直链麦芽低聚糖是指由3¹0个α-D-吡喃葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接的功能性低聚糖,在食品、医药、化工等多种领域具有广泛的应用前景。其可通过直链麦芽低聚糖生成酶（简称MFA酶）水解淀粉得到。目前,直链麦芽低聚糖的工业化生产被少数发达国家所垄断,因此开发具有工业应用价值的MFA酶对推动国内直链麦芽低聚糖产业的发展具有重要意义。本课题以来源于Bacillus stearothermophilus STB04的MFA酶（Bst-MFA酶）为研究对象。首先,构建了Bst-MFA酶的枯草芽孢杆菌分泌表达系统,并对基因工程菌的摇瓶发酵条件进行了优化。确定最佳培养基组成为:酵母粉30 g/L,玉米淀粉6 g/L,KH₂PO₄ 2.3g/L,K₂HPO₄ 12.5 g/L,pH 7.5。在最适发酵温度37oC下摇瓶培养（200 r/min）48 h后发酵上清液酶活达451.1 U/mL,比初始培养条件下的酶活水平提高了127.5%,比文献报道水平提高了10.9倍。其次,采用疏水层析对粗酶进行了纯化,并分析了酶学性质。结果显示,Bst-MFA酶的最适反应温度为75oC;在60、65、70、75oC下的半衰期分别为120、51、24、13 min,80oC下半衰期小于5 min。其最适反应pH为5.5,但在pH 8.5的Gly-NaOH缓冲液中稳定性最佳。测定重组酶水解不同底物的动力学参数,发现其对麦芽糊精的亲和力和催化效率最高;Bst-MFA酶对支链淀粉的亲和力和催化效率均高于直链淀粉,这可能是因为直链淀粉分子之间的作用较强,酶和底物结合相对较难,支链淀粉的簇状结构则大大增加了两者结合的几率。此外,Bst-MFA酶对金属离子存在依赖性;0.5 mM K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Ba²⁺能轻微促进酶活力;0.5 mM Fe³⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺则显著抑制酶活力;0.5 mM Na⁺和Ca²⁺均可提高该酶的热稳定性。进一步发现了Na⁺、Ca²⁺可协同改善重组酶的热稳定性,且10 mM Ca²⁺和40 mM Na⁺的协同效果最佳:酶液在80oC下保温3 h后残余酶活力（71.1%）是单独添加10 mM Ca²⁺的4.7倍、单独添加40 mM Na⁺的5.8倍。用SWISS-MODEL进行Bst-MFA酶的晶体结构模拟,发现其活性中心（α/β）₈-桶状域的延伸处存在一个Ca²⁺-Na⁺-Ca²⁺结合位点,可能与酶热稳定性相关。圆二色谱和内源荧光分析结果表明,当Ca²⁺、Na⁺同时存在时,二级结构中α-螺旋与β-折叠含量比（α/β）的变化程度最小,同时酶蛋白最大荧光强度(FI_max)的损失最小。这说明Ca²⁺-Na⁺-Ca²⁺三联体可有效维持二级结构正确、有序的折叠,并保护重组酶的三级构象。最后,探究了Bst-MFA酶的反应模式和产物合成规律。结果显示,Bst-MFA酶可有效降解长链直链麦芽低聚糖（DP值>6）,过度反应可降解G6,而基本不降解G5。以Taka淀粉酶A、β-淀粉酶作为对照,发现Bst-MFA酶水解淀粉时更倾向于内切模式。用HPAEC-PAD分析产物组分,结果显示,Bst-MFA酶充分水解直链淀粉和支链淀粉后均生成G1^G7,且直链淀粉的转化率高于支链淀粉;但支链淀粉反应体系中主产物（G5+G6）占G1^G7总量的相对比例比直链淀粉反应体系中高24.2%。进一步对制备直链麦芽低聚糖的反应体系进行了优化,确定了反应pH为6.0、Bst-MFA酶的添加量为5 U/g干基淀粉、60oC下以5%（w/w）玉米淀粉为底物反应48 h,可实现74.6%的底物转化率和58.8%的主产物比例。在反应开始时同时加入2 U/g干基淀粉的普鲁兰酶可进一步提高底物转化率至101.2%,同时仍能维持55.0%的主产物比例。