B7-H4分子是近年发现的一个新的协同刺激分子,其基因定位于1p11.1,编码282个氨基酸,属于免疫球蛋白超家族。人B7-H4分子的mRNA广泛的存在于淋巴组织和非淋巴组织。新鲜分离的外周血T、B淋巴细胞、单核细胞及树突状细胞均无B7-H4的表达,但体外刺激后,均可被诱导表达。近来的研究表明,B7-H4分子属于负性调节分子,它可以抑制T细胞的增殖,细胞因子的分泌以及细胞周期的进行,从而下调T细胞的免疫功能。虽然B7-H4蛋白在大多数正常组织中几乎不表达,但其在一些肿瘤细胞上的过表达,说明B7-H4分子在帮助肿瘤细胞逃避免疫监视过程中起到重要作用,另外B7-H4在维持机体免疫耐受过程中也起到重要的作用。因此,该分子成为免疫学研究的热点之一。本研究旨在通过克隆人B7-H4基因,并建立人B7-H4基因转染细胞株,研制特异性鼠抗人B7-H4单克隆抗体,并对其生物学功能进行初步的研究。一、人B7-H4基因转染细胞株的构建及其生物学功能的初步研究【目的】克隆人B7-H4基因,将其转染至pIRES2-EGFP真核表达载体,构建人B7-H4转基因细胞株并初步研究其生物学功能。【方法】通过RT-PCR的方法获得人B7-H4分子的全长基因,设计特异性引物,通过PCR方法获得目的片段,将目的片段双酶切(EcoR I和BamH I)后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP/B7-H4并进行鉴定;脂质体转染法将重组载体导入L929细胞,经G418加压筛选并通过流式细胞术和RT-PCR检测表达载体是否转入L929细胞中,通过检测活化T细胞上CD25,CD69的表达及T细胞增殖实验对B7-H4转基因细胞的生物学功能进行初步研究。【结果】构建了一株稳定高表达人B7-H4分子的转基因细胞株,对其生物学功能的研究显示B7-H4分子可以下调活化T细胞上CD25,CD69的表达,并且对T细胞的活化增殖起到抑制作用。【结论】成功构建一株稳定表达B7-H4分子的基因转染细胞株,为进一步研制B7-H4分子的单克隆抗体提供了有效的免疫原。二、B7-H4单克隆抗体的制备及其生物学特性的研究【目的】研制鼠抗人B7-H4分子的单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性【方法】以高表达人B7-H4分子的转基因细胞L929/B7-H4为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴瘤杂交技术,经免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选、多次克隆化培养,获得两株可特异分泌鼠抗人B7-H4分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用快速定性试纸分析法鉴定抗体所属的Ig亚类。用Dot-blot、Western blot鉴定单抗的特异性,竞争结合抑制实验鉴定单抗所识别的抗原结合位点,T细胞增殖抑制阻断实验对单克隆抗体的生物学功能进行初步的鉴定。【结果】获得两株持续、稳定地分泌抗B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1F10和2B2。Dot-blot的结果显示,两株单抗均能特异性识别B7-H4分子。Western blot检测显示,单抗2B2可以特异性识别B7-H4分子,而单抗1F10则不能识别。位点竞争实验表明,两株单抗之间,单抗1F10与商品化的抗体H74之间识别位点均不同,单抗2B2与商品化抗体识别位点相近。T细胞增殖抑制阻断实验显示,这两株单抗均能一定程度地阻断B7-H4对T细胞增殖的抑制作用。【结论】成功地获得两株鼠抗人B7-H4分子的单克隆抗体,为进一步研究B7-H4分子的生物学功能提供了有效的工具。综上所述,本研究成功构建了基因转染细胞株L929/B7-H4,并以此为免疫原成功获得两株能稳定分泌鼠抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株。T细胞体外增殖实验表明,L929/B7-H4可以抑制T细胞的增殖,同时加入B7-H4单抗,可以在一定程度上阻断这种抑制效应,为进一步研究B7-H4分子生物学功能奠定了物质基础。