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目的:鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis,以下简称鼠疫菌）、炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis,以下简称炭疽菌）、类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,以下简称类鼻疽菌）、布鲁氏菌（Brucella,以下简称布氏菌）和土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis,以下简称土拉菌）均是具有高传染性、高致病性的烈性病原菌。历史上由鼠疫菌引发的世界范围内的鼠疫三次大流行给人类的社会,历史,文化造成深远影响。同时,炭疽菌,布氏菌等又因其制备简单,隐蔽性强等特点,易被制成生物战剂和生物恐怖剂,对社会稳定和人们的生命健康构成严重威胁。鉴于这些病原菌致病性强、病死率高、制备成本低、释放隐蔽性强等特点,建立起对病原菌快速、特异、准确的检测方法就显得格外重要。数字PCR（Digital PCR,d PCR）技术是20世纪90年代发明的一种定量检测方法,因其高灵敏性、高特异性、绝对定量的特点已经在临床疾病突变基因检测、产前基因筛查、病原检测等方面得到广泛应用。但受到数字PCR检测通道少等技术限制,目前的研究多集中在单一靶标检测或多个等位基因的突变检测,对多个烈性病原菌的同时检测相关研究较少。本研究旨在基于现有双光路数字PCR检测平台,建立起对上述五种烈性病原菌的多重核酸检测方法。方法:（1）数字PCR单一靶标菌检测体系的建立与性能评价:分别配置单一靶标菌的数字PCR反应体系和实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,q PCR）反应体系,对靶标菌种的基因组进行倍比稀释检测并比较两种核酸检测方法的检测灵敏度。同时,对五种靶标菌数字PCR反应体系之间进行特异性评价。（2）数字PCR多重检测体系的建立及性能评价:首先,比较并评价探针浓度法,多探针混合标记法,双色荧光探针法等多种实现数字PCR多重检测方法的优劣。进而,确定利用探针浓度法与双探针混合标记法结合的方式建立本研究中五种烈性病原菌的数字PCR多重检测体系。并对建立的多重检测体系的灵敏度,特异性,定量准确性,抗干扰能力等进行评价。（3）数字PCR文献计量方法研究:以文献计量学方法提取2000年～2019年20年间Pub Med数据库收录所有数字PCR文献的主要主题词/副主题词。以主要主题词/副主题词词篇矩阵和共现矩阵为基础进行聚类分析,战略坐标分析和社会关系网络图分析,综合以上分析结果,评估数字PCR技术在20年间的研究整体概况以及研究热点和研究潜力。结果:（1）数字PCR单靶标检测体系对五种靶标菌的基因组模板具有较高的检测灵敏度,与目前应用较广泛的q PCR检测结果相比,在鼠疫菌,类鼻疽菌和炭疽菌检测中保持一致,检测灵敏度为0.1 pg/μL。在布氏菌和土拉菌的检测中数字PCR单靶标检测体系的检出限更低,为0.01 pg/μL。在单靶标检测体系特异性评价中,只有特异的模板在特异体系中被检出,表明五种数字PCR检测体系之间具有较好的检测特异性。（2）最终确立的数字PCR多重检测体系中荧光探针组合为:鼠疫菌,单FAM荧光探针标记,体系终浓度为500 n M;类鼻疽菌,单FAM荧光探针标记,体系终浓度为250 n M;炭疽菌,FAM荧光探针和HEX荧光探针混合标记,体系终浓度分别为250 n M;布氏菌,单HEX荧光探针标记,体系终浓度为500 n M;土拉菌,单HEX荧光探针标记,体系终浓度为750 n M。数字PCR多重检测体系检测灵敏度较数字PCR单靶标检测体系有所下降但与q PCR检测灵敏度保持一致（0.1pg/μL）,能满足检测需求。在特异性评价中表现出良好的检测特异性。在多靶标同时检测中保持良好的定量准确性。模拟土壤样本检测中数字PCR多重检测体系相较于q PCR检测体系表现出更低的检测灵敏度和更强的抗干扰能力。（3）关于数字PCR发表文献数量在20年间（2000年～2019年）呈逐年上升趋势。通过聚类分析将检索到的文献分为5个大的聚类结果,分别为肺癌突变基因快速检测方面的应用,原癌基因突变检测方法的建立与临床应用,液体活检概念的提出及应用,无创产前检查及分子诊断等方面的应用和妇科肿瘤检查及监测中的应用。通过战略坐标分析可知肺癌突变基因快速检测方面的应用,原癌基因突变检测方法的建立与临床应用在目前的研究中处于核心位置,是研究者关注的热点领域。社会关系网络图分析同样显示出“Lung Neoplasms/*genetics”,“Molecular Diagnostic Techniques/*methods”和“DNA Mutational Analysis/*methods”处于整个网络的中枢位置,同时网络提示“Viral Load/*methods”位于现有网络的边缘位置,具有巨大研究潜力。结论:本研究基于双光路数字PCR检测平台,建立了一种针对五种烈性病原菌的多重检测体系,为重要生物威胁病原菌的筛查以及其他病原体的检测提供新的技术支持并为数字PCR技术开展多重检测提供新思路。