本论文旨在将现代分离分析技术应用于低分子量肝素(LMWHs)精细结构分析和活性研究，以及靶向蛋白激酶药物的筛选及抑制剂选择性研究。论文分为以下两部分:　　 第一部分:低分子量肝素的精细结构分析和活性测试作为一类抗凝血药物，LMWHs在临床上用于治疗肺栓塞、脑栓塞及手术后预防血栓的形成。在此类药物中，依诺肝素钠（Enoxaparin sodium）是全球销量前20位的药物，年销售额在30-40亿美元。2010年美国FDA通过法案，批准依诺肝素钠仿制药物上市，但要求从结构上证明仿制药物与专利药物具有等同性。因此，低分子肝素精细结构的分析方法很快成为学术界和制药界关注的焦点。此外，随着肝素越来越多的生物活性（如抗肿瘤活性）被发现，需要强有力的分析方法用于结构与生物活性关系的研究。　　 我们提出一种新的全面分析依诺肝素精细结构的策略:即用超高效体积排阻色谱/飞行时间质谱(UPSEC/Q-TOF-MS)对完整的LMWHs糖链结构进行从上而下(top-down)的轮廓分析(profiling)，另一方面用毛细管区带电泳对构成糖链的模块(building blocks)进行自下而上的(bottom-up)的定量分析。两种分析方法分别提供互补的结构信息。通过UPSEC/Q-TOF-MS鉴定出依诺肝素钠中具有1，6-成环结构、非还原端为饱和糖醛酸，以及糖链数为奇数的6类70多种寡糖链结构。Bottom-up定量分析需要将依诺肝素用混合肝素酶溶液彻底水解成building blocks。用建立的毛细管电泳方法可实现包含有10个二糖，1个三糖，2个四糖，特别重要的是4个带有1，6-成环结构的酶解液的分离。电泳缓冲液中加入的PEG和MgCl2对于改善共迁移寡糖的分离至关重要。另外，我们首次依据硫酸化寡糖的电泳淌度与其电荷-质量比呈线性关系的原理，提出用标准插入法归属电泳图中那些没有标准品的硫酸化寡糖的方法，从而保证了定量分析的准确性。这一研究成果为低分子肝素类药物的质量控制以及肝素结构与生物活性关系研究提供了关键技术。　　 我们还发展了一种基于体积排阻色谱-液相色谱(SEC-HPLC)方法测试低分子量肝素的抗凝血因子Xa(FXa)活性的方法。该方法利用自动进样器依次完成LMWH、ATⅢ、FXa和生色肽底物溶液的混合、孵育，底物被FXa水解，产生游离的对硝基苯胺，这大大简化了繁琐的传统手工操作程序，同时极大的减少了样品的消耗量，大大降低了成本。实验中只需使用一根长30mm的体积排阻色谱预柱即可实现复杂酶反应液中的对硝基苯胺与其他成分的分离，因此可以在硝基苯胺的最大吸收波长下对游离发色团定量测定且不再受酶反应液中其它成分的干扰，拓展了样品的应用范围。该方法为低分子量肝素的活性测定提供了一个简单、高效、低成本和自动化的工具，可直接用于肝素和低分子量肝素生产过程中的质量控制。该方法还可用于各种复杂样品如血浆中低分子肝素抗FXa活性的监测，这对肝素临床治疗和疗效评价有着重要的意义。　　 第二部分:蛋白激酶小分子抑制剂选择性研究。　　 蛋白激酶参与调控了几乎所有的细胞生理活动，如细胞生长、分化、代谢和凋亡。蛋白激酶功能的失调与各种疾病如肿瘤、炎症、糖尿病等的发生发展密切相关，因此，蛋白激酶成为当前最重要的药物靶标之一。然而蛋白激酶活性区域的高度保守性使得蛋白激酶抑制剂的选择性成为困扰药物研发的主要问题。蛋白激酶抑制剂在生物体内如果作用于多个靶点，有时可能会产生毒副作用，而另一种情况下又可能产生更好的疗效或者对另一种疾病的治疗取得更显著的疗效。因此研究药物选择性对预测新药的毒副作用和开发现有药物新用途都有着重要意义。本文侧重于发展用于研究蛋白激酶抑制剂选择性问题的新分析技术。　　 我们发展了毛细管电泳(CE)-激光诱导荧光(LIF)的细胞内源多元激酶的抑制剂平行筛选及选择性评价方法。由于CE高效的分离能力和LIF检测器的高选择性，使得同时测试多个细胞内源激酶的活性成为可能。细胞裂解液作为一种廉价的激酶来源可以大大降低筛选成本。四种细胞系，三种特异性蛋白激酶底物肽，两种选择性蛋白激酶抑制剂和一种非选择性蛋白激酶抑制剂用于方法的建立。特异性底物肽，与细胞裂解液混合后孵育，底物肽被其相应的激酶择性地磷酸化，利用CE-LIF分离检测磷酸化产物和底物肽。三种抑制剂的活性可以通过产物峰面积的变化得到测定。同时测定一个抑制剂对几种蛋白激酶的抑制活性可以用于评价抑制剂的选择性。与传统的单靶标筛选模式相比，这种基于细胞裂解液的多靶标筛选方法能提供更多的信息，更加直接，更加经济。　　 具有α，β-不饱和羰基结构的蛋白激酶抑制剂是发展第四类抗肿瘤药物的基石。这类化合物能够通过Michael加成反应与靶标蛋白激酶活性位点的半胱氨酸残基形成不可逆的共价键，因而具有极高的效价，并且不受耐药性问题的困扰。然而不可逆性抑制剂固有的反应性也可能造成比可逆抑制剂更加严重的毒副作用。因此，开展这一类激酶抑制剂选择性研究方面的工作，对于降低第四类蛋白激酶药物的研发风险将具有非常重要的指导意义。本文以处于临床测试阶段的两个化合物neratinib和pelitinib为研究模型，将发展一种无标记的研究不可逆抑制剂在细胞内作用靶标的方法。该方法将结合免疫亲和富集和LC-MS/MS的技术。实验步骤包括:培养抗小分子的特异性抗体，制成亲合色谱柱;在细胞培养过程中加入不可逆蛋白激酶抑制剂，裂解细胞，提取总蛋白，水解蛋白质成肽段;最后用固定有抗小分子特异性抗体的亲合色谱富集结合有小分子的的肽段，然后用nanoHPLC-MS/MS分析这些肽谱，鉴定出靶标蛋白的种类。目前我们已经制备出两种抗小分子的抗体，其ELISA测试和WB结果显示抗体的效价和特异性都较好。细胞实验和质谱分析实验还在进行中。