[目的] 角膜新生血管的发生严重威胁视力,多种眼表的炎症、感染、退变和外伤等常可诱发正常角膜组织发生新生血管。由于其发生涉及多因素、多交叉环节,确切发病机制尚不明,目前临床尚无特效的根治手段,其治疗仍然很棘手。因而,积极探求在角膜新生血管发生生长过程中多种作用机制,对联合不同的抑制途径以提高临床抗新生血管治疗效果有着重要的意义。本课题主要依据新生血管发生过程最初阶段必须通过基质金属蛋白酶消化血管内皮层下的细胞外基质,使内皮细胞趋化、迁移通过基底膜的过程得以完成这一机制,采用角膜缝线诱导建立大鼠角膜新生血管模型,研究基质金属蛋白酶-2的表达和酶活性变化,探讨基质金属蛋白酶在大鼠角膜新生血管发生中作用的调控机制;并评价对基质金属蛋白酶有抑制作用的血管紧张素转换酶抑制剂Captopril对角膜新生血管生长的干扰作用及可能的交叉机制。[方法](1)选取雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,在角膜基质层置间断缝线3针制作角膜新生血管模型,分单眼模型和双眼模型。采用裂隙灯显微数字图像处理系统对角膜照相,拍摄缝线前和缝线后2d、4d、6d、8d从角膜缘血管网扩张开始至新生血管生长延伸的动态过程;观察角膜新生血管模型的病理学改变。(2)采用单眼模型,缝线后第8天处死大鼠,取双眼球放入液氮保存(用于荧光定量PCR或明胶酶谱分析)或4%多聚甲醛溶液组织固定(免疫组织化学分析),观察MMP-2在新生血管角膜表达的改变和酶活性的改变。(3)采用双眼模型,缝线后8d处死大鼠,分组:正常角膜对照组、角膜新生血管对照组、Captopril灌喂组、Captopril球结膜下注射组、地塞米松球结膜下注射组,比较各组新生血管生长情况、新生血管面积,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGFmRNA的表达,免疫组织化学方法检测VEGF蛋白质水平表达的变化。[结果] (1)正常角膜缘可见血管网呈环状围绕角膜一周;角膜缝线后第2d<WP=6>可见角膜缘血管环充血扩张、角膜缝线处水肿隆起;第4d可见从角膜缘伸入角膜的毛刷状小血管、角膜水肿范围扩大;第6d新生血管垂直角膜缘切线向缝线方向延伸、密度均匀、角膜水肿继续加重;第8d新生血管延伸到达或超过缝线位置。(2)荧光定量PCR检测发现正常角膜Ct值为:20.62±0.56;新生血管角膜Ct值为:20.25±0.98;二者t检验比较无显著性差异(t=0.939,P>0.05),表明正常角膜和新生血管角膜MMP-2起始基因拷贝数无差异、在新生血管角膜MMP-2mRNA表达无增强;组织病理学显示:在角膜新生血管模型见角膜基质层大量新生血管横断面和炎性细胞浸润;免疫组织化学染色发现MMP-2在正常角膜基本无表达,而在新生血管角膜上皮层和基质层染色明显增强、并主要分布在基质层角膜新生血管和炎性细胞浸润区域;明胶酶谱法检测发现MMP-2在新生血管角膜的酶谱中可区分出72kDa的MMP-2酶原和62kDa的活性酶,而在正常角膜主要以72kDa酶原形式存在,检测不到MMP-2活性酶条带。MMP-2酶原在新生血管角膜和正常角膜中的含量(积分光密度IOD值)分别为:6.93±0.75和4.99±0.53,二者有显著性差异(t=7.728,P<0.01);新生血管角膜MMP-2活性酶表达的IOD值为0.47±0.13。(3)双眼模型各组角膜新生血管面积(S):对照组S1=14.43±2.10;captopril灌喂组S2=11.36±3.74;captopril球结膜下注射组S3=6.46±2.26;地塞米松球结膜下注射组S4=5.72±1.40。对照组S1与captopril灌喂组S2比较:t=2.938,p<0.01,二者有非常显著性差异;captopril灌喂组S2与captopril球结膜下注射组S3比较:t=4.885,p<0.01,二者差异也有非常显著性;captopril球结膜下注射组S3与地塞米松球结膜下注射组S4比较:t=1.874,p>0.05,二者无显著性差异;角膜新生血管对照组的角膜新生血管生长旺盛、生长长度到达或超过缝线位置;Captopril灌喂组新生血管生长个体差异较大、整体较对照组生长稀疏、新生血管长度短;而在Captopril球结膜下注射组角膜新生血管不仅生长长度和范围明显小于对照组,而且其密度明显稀疏。Captopril灌喂和球结膜下注射均抑制了角膜新生血管生长,二者新生血管生长面积也有显著性差异,以后者的效果更为明显、其与地塞米松抑制新生血管生长的效果相当。(4)半定量逆转录聚合酶链式反应检测结果显示:正常角膜组、角膜新生血管对照组及captopril球结膜下注射组(8d)的VEGFmRNA相对表达量分别是:0.260±0.076,1.296±0.201,0.529±0.097;新生血管对照组较正常<WP=7>组明显增高(t=14.82,p<0.01),captopril球结膜下注射组较新生血管对照组明显减少(t=10.45,p<0.01)。免疫组织化学检测发现VEGF在正常角膜没有表达或在上皮基底膜有弱表达;新生血管对照组角膜全层VEGF表达明显增强,其表达部位主要分布在形成的新生血管区域和上皮全层;captopril球结膜下注射组较新生血管对照组在角膜基质层新生血管密度明显减低、相应部位的VEGF表达也显著减少。[结论](1)本实验采用的缝线法诱导角膜新生血管模型,在第8d进行定量比较分析有较好的重复性和准确性。(2)在角膜新生血管发生过程中MMP-2酶活性增强、且在角膜基质层形成新生血管的区域表达明显增强,但无相应转录水平的提高,提示MMP参与角膜新生血管形成的主要作用形式是激活的活性蛋白酶。(3)Captopril抑制基质金属蛋白酶活