论文部分内容阅读
背景:宫颈癌是妇科最为常见的恶性肿瘤,其发病率呈现逐年上涨的趋势,并且宫颈癌发病趋向年轻化。目前宫颈癌的发病机制研究尚不十分明确,临床治疗多以手术扩大切除以及放/化疗为主,给宫颈癌患者尤其年轻患者带来巨大创伤。因此针对宫颈癌的早期诊断、预防及合理有效的治疗显得尤为重要。目前,HPV感染作为宫颈癌发病的风险因素已得到公认,HPV感染启动下游相关机制导致HPV病毒颗粒的不断复制、感染以及宫颈上皮细胞的恶性增殖是宫颈癌发病的主要原因,但是HPV感染影响下游的关键分子和信号通路尚不十分明确,限制了宫颈癌的早期快速筛查以及靶向性生物治疗的快速发展和应用。因此,针对HPV感染下游关键机制进行解析,寻找高效特异的靶分子用于宫颈癌的诊断和靶向治疗研究具有重要的临床意义。BCAP31是B细胞受体相关蛋白家族的重要成员,主要定位于内质网,负责多种蛋白向高尔基体的转运。BCAP31作为载体蛋白在介导膜整合蛋白质的锚定以及转运、错误折叠蛋白的识别及降解、调节Caspase依赖的细胞凋亡等方面发挥重要功能。本课题组前期利用自己独创的生精细胞特异性单克隆抗体筛选肿瘤/睾丸抗原的方法,结合免疫沉淀-质谱分析鉴定,获得一个新的肿瘤/睾丸抗原BCAP31。利用组织芯片分析其蛋白表达规律,发现BCAP31分子在人正常组织中不表达(除睾丸组织外),在宫颈、卵巢、肺、乳腺、肝脏、食道、直肠和结肠等肿瘤组织中显著高表达,其中以宫颈癌组织中BCAP31的表达强度和阳性率最高可达87.5%,提示BCAP31作为一个新的肿瘤/睾丸抗原可能参与宫颈癌的发病。本课题拟从临床样本入手,明确BCAP31与宫颈癌发生、发展及转移的关联性,并进一步探讨BCAP31调节宫颈上皮细胞增殖、侵袭和迁移的作用,揭示宫颈癌发生发展过程中BCAP31的关键作用及其分子机制,从而深化对宫颈癌发病机理的认识,并为其治疗提供新的思路。目的:1.系统分析BCAP31在宫颈癌患者组织中的表达变化,明确BCAP31表达水平与宫颈癌发生、发展及转移的相关性;2.探讨BCAP31对宫颈癌细胞系相关生物学行为的影响;3.研究BCAP31影响宫颈癌细胞生物学行为可能的分子机制,阐明BCAP31在宫颈癌发生发展中的重要作用。方法:1.临床收集不同病理分级的宫颈癌组织标本,利用Western blot,Real-time PCR以及免疫组织化学染色分析BCAP31在宫颈癌患者组织中的表达,统计学分析其与肿瘤大小、临床分期、病理分级、是否发生远端转移以及患者生存期等临床指标的关联性;2.利用siRNA特异性干涉宫颈癌细胞系中BCAP31的表达,从细胞生长、周期、凋亡、迁移和侵袭等多个方面评估BCAP31对宫颈癌细胞生物学行为的影响;3.构建BCAP31干涉后低表达的稳转细胞系,结合裸鼠荷瘤模型,从瘤体大小、肿瘤转移、小鼠生存等指标分析BCAP31对宫颈癌发生发展的影响;4.利用免疫共沉淀、激光共聚焦等方法,研究与BCAP31相互作用的靶分子,并对其进行干涉,分析下游相关分子和功能变化,研究BCAP31影响宫颈癌发生发展的内在分子机制。结果:1.Real-time PCR和Western blot分析结果显示,BCAP31在宫颈癌患者肿瘤增生组织显著高表达,而在周边正常组织BCAP31仅有微量表达;2.161例宫颈癌患者组织免疫组化染色结果显示,高表达BCAP31的例数为135例,占总例数的83.6%;相关性分析结果显示,BCAP31高表达可能与患者淋巴结转移,肿瘤分化程度以及宫颈癌临床分期密切相关;3.107例宫颈癌患者电话回访后生存分析结果显示,BCAP31高表达的患者术后生存时间明显缩短;4.细胞功能学研究发现,干涉宫颈癌细胞系BCAP31的表达后,细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到明显的抑制;5.Western blot和周期分析结果显示,干涉宫颈癌细胞系BCAP31的表达后细胞周期蛋白Cyclin D、Cyclin E和Cyclin E2的表达受到明显抑制,同时细胞处于G1期阻滞;6.成功构建BCAP31稳转干涉Hela细胞裸鼠荷瘤模型,在该模型中下调BCAP31表达后,Hela细胞的成瘤能力明显降低、荷瘤小鼠的存活时间明显延长,细胞向肝脏转移能力受到抑制;7.免疫共沉淀及Western blot结果显示,BCAP31具有调节侵袭迁移相关蛋白Drebrin、M-RIP、SPECC1和Nexilin的表达和亚细胞定位的功能;8.进一步功能分析发现,BCAP31主要通过调节Drebrin的表达和亚细胞定位,影响细胞内F-actin的装配,发挥其调节宫颈癌细胞侵袭迁移能力。结论:通过本课题的研究,我们首次明确了肿瘤/睾丸抗原BCAP31与宫颈癌发生发展的关联性,揭示了BCAP31在调节宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭参与宫颈癌恶化中的作用及其分子机制,进一步丰富宫颈癌的发病机制研究,同时针对BCAP31进行靶向干预有可能成为宫颈癌新的治疗策略。