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群体感应(Quorum sensing)是一种细菌间信息交流的机制。不同细菌合成和分泌不同的信号分子,其浓度随着细菌密度的增大而升高,当达到一定阈值后即启动细菌特定基因的表达。N-3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯(30C12-HSL)是人类三大机会致病菌之一铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)群体感应系统的信号分子,人血清对氧磷酶(Paraoxonases,PONs)和芽胞杆菌的AiiA蛋白均为能降解3OC12-HSL的内酯酶,可以失活30C12-HSL,从而干扰PA群体感应系统。PONs包含三个家族成员:PON1,PON2和PON3。虽然最初发现PON1的底物是对氧磷,但实际它能水解包括芳香酯类、内酯类、有机磷等在内的多种底物,PONs还具有抗氧化和抗动脉粥样硬化的功能,在医学、环境保护、军事和农业上都具有应用价值。
本研究首先采用原核和真核表达系统表达PONs蛋白。将该家族的三个基因克隆至原核表达载体pET28a,pET32a和pCold/GST上,在大肠杆菌表达系统中均获得融合His-Tag,Trx-Tag和GST-Tag的重组蛋白的表达。PON1,PON2和PON3的最高表达量分别达到100 mg/L,85 mg/L和30 mg/L,但均主要以包涵体形式存在,经复性后的蛋白活性也较低。通过pPIC9K载体将ponl重组至巴斯德毕赤酵母基因组,在重组酵母中获得了PON1的表达,但在酵母表达系统中获得的重组PON1蛋白的表达量较低。
苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白和PONs-样,能水解PA的信号分子30C12-HSL。本研究利用大肠杆菌表达系统诱导AiiA蛋白的可溶性表达,纯化后的活性分析表明重组AiiA蛋白保持了良好的天然生物学活性,能有效降解底物3OC12-HSL。将PONs和AiiA的编码基因通过pMEKm12载体转化PA标准株PAO1,发现重组菌在非生物活性表面形成生物膜(biofilm)的能力远低于野生型和空载体对照菌株;通过抗体中和实验和AiiA蛋白体外实验证明,生物膜形成能力的减弱是由重组菌中表达的PONs和AiiA蛋白引起的。药敏实验结果表明,PONs的表达能降低PAO1对常用抗生素头孢他啶和硫酸庆大霉素的耐药性。