栓皮栎(Quercus variabilis Bl)是我国重要的生态经济林木树种。除能进行木材,薪材,食用菌,天麻,橡子,栲胶生产外,最重要的是它是我国最主要的软木资源树种。由于多年竭泽而渔的利用方式,致使基因资源大量丢失,经济和生态效益下降。因此,必须开发栓皮栎保存和遗传改良的技术。由于栓皮栎种子不耐贮藏;结实期晚,产量低,轮回期长,每3～5年出现一次种子大年,因此不利于建立种子园;栓皮栎生根困难,难以常规方法无性繁殖;由于生理老化,成年材料通过器官发生再生植株也较困难等,这些成为栓皮栎基因资源保存、快繁和遗传改良的限制因子。体细胞胚胎发生生物技术为林木种质保存、快速繁殖性状优良的植株和遗传改良提供了新途径。因此,开展栓皮栎体细胞胚胎发生技术研究具有重要的实践价值和应用意义。本研究首次对栓皮栎体细胞胚胎发生技术进行了系统的研究。建立了一套完整的栓皮栎体细胞再生植株体系,筛选出了适宜栓皮栎体胚诱导、成熟和萌发的培养基及培养条件,获得了体胚再生植株;初步分析了胚性组织及萌发植株的遗传稳定性。揭示了栓皮栎体胚的起源和发育过程。通过分析栓皮栎体胚发生过程中的生化特性变化,探讨了外源因素在栓皮栎体胚成熟中的调控作用。本研究结果填补了我国栎类树种体胚再生植株的空白。为栓皮栎基因资源保存、优良材料快繁和遗传改良开辟了一条行之有效的新途径。主要研究结果如下:1.栓皮栎合子胚、2个月实生苗的叶片和茎段均能诱导体细胞胚胎发生。7月中旬发育的未成熟合子胚在添加0.5mg/L的6-BA和2,4-D的MS基本培养基中诱导率达90%,无激素仅16.7%。单独使用6-BA以直接体胚发生为主,2,4-D无论是单独使用还是与6-BA配合使用,均以间接体胚发生为主。母树基因型对体胚诱导率有显著影响。栓皮栎体胚可以通过胚性愈伤组织非组织化生长的方式和重复性体胚发生方式增殖。在附加1mg/L 6-BA和0.25mg/L NAA的培养基上栓皮栎体胚增殖最好。2.栓皮栎成熟体胚的形态标志是,子叶肥厚,乳白色(象牙色)或浅黄色到黄绿色不透明,下胚轴粗壮并延伸成胚根、直径大小约为5～8 mm。在3%的低糖培养基中,体胚成熟率仅为15.6%,体胚萌发率为7.5%。培养基中附加ABA对体胚的正常成熟有明显的促进作用。MS基本培养基中添加0.5 mg/L ABA、0.5mg/L PVP,以及5%蔗糖是栓皮栎体胚成熟的较佳处理,可使体胚成熟率达到70.4%。在3%蔗糖的1/2MS培养基上,同时添加0.5mg/L 6-BA和0.25mg/L IBA的萌发培养基中,体胚的萌发率及再生植株率分别达到65.9%和9.4%。3.栓皮栎体细胞染色体数目2n=24。继代8个月的胚性愈伤组织细胞的染色体数目和结构相对稳定,其中二倍体细胞占97.20%,四倍体细胞占1.87%,单倍体细胞占0.93%。未发现有非整倍体细胞和染色体形态结构变异。子叶期体胚胚轴亚表层起源的分生组织团中有些细胞核呈片状或椭圆形。个别成熟体胚中偶见有3核细胞。在萌发体胚未发现染色体数目的异常。4.组织学观察表明,栓皮栎体细胞胚直接起源于胚性细胞团表皮或近表皮的单细胞,经历与合子胚相似的球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚发育阶段。在未成熟合子胚萌发的胚轴上产生直接不定体胚,这是不经过愈伤组织而从表皮层细胞出现的不定改变。组织学观察到在表皮层有单个染色较深,无液泡,细胞壁较厚的细胞。因此,栓皮栎胚性愈伤组织可以作为农杆菌介导转化的受体。由于栓皮栎体胚存在单细胞外起源,利用胚性愈伤组织作为受体可以得到非嵌合体转化植株。5.栓皮栎胚性愈伤组织中的可溶性糖、可溶性蛋白质含量和抗氧化物酶活性明显高于非胚性愈伤组织。在栓皮栎体胚成熟培养过程中,蔗糖培养基中的抗氧化物酶活性均较小。当蔗糖浓度从3%提高到5%,可使成熟体胚内源可溶性糖的含量显著增加(3.08到4.81mg·g/FM)。高浓度的蔗糖(5%和8%)使成熟胚的可溶性蛋白质含量增加。在成熟培养基中附加0.5 mg/L的ABA,成熟胚中的可溶性糖含量有所增加,提高ABA浓度不利于成熟体胚中的可溶性糖含量的累积。不同浓度ABA处理也使成熟胚的可溶性蛋白质含量有所增加。通过分析发现,成熟体胚中可溶性糖含量与体胚成熟率和萌发率紧密相关。以上从理论上说明,栓皮栎成熟培养基适宜的碳源是蔗糖,适宜的浓度是5%,附加0.5mg/L ABA是有利于栓皮栎体胚的成熟。