论文部分内容阅读
多糖又称为多聚糖,是由糖苷键连接的醛糖或酮糖聚合而成、聚合度大于1O的极性天然大分子,其分子量一般为数万甚至达数百万,几乎存在于所有的有机体中,包括动物、植物、微生物(细菌和真菌)及海藻,是生物体内重要的生物大分子,是维持生命活动正常运转基本物质之一。多糖具有重要的生物功能,也具有重要的药用价值。中药作为人类维护健康体系的一个重要组成部分,大多数是天然药物,作为中药主要有效成分之一的多糖,具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗辐射、降血糖、降血脂、保肝等多种功能,其中中药多糖的免疫调节活性及抗肿瘤作用以及低毒特征倍受关注,在临床应用中已呈现出极大的潜力,成为天然药物研究的一个新的增长点。随着现代科技以及分子生物学的发展,对多糖的研究已经深入到细胞和分子水平,但对其口服后的作用途径还不甚了解。既往人们对多糖的研究局限于传统的免疫细胞,而对其口服后与人体最先最广泛接触的细胞—肠上皮细胞间的作用研究不多。肠上皮细胞是人体第一道防线,参与固有免疫反应并可以作为抗原提呈细胞递呈抗原,且与肠粘膜的其它免疫细胞存在“对话”,多糖是否可以作用于肠上皮细胞,对肠上皮细胞的吞噬递呈能力以及相应的细胞因子、趋化因子、防御素以及其它介质的分泌进行调节,直接杀伤靶标或通过加强、或减弱肠上皮细胞与其它免疫细胞的相互作用,进而发挥其药理作用。研究口服多糖在肠道的作用方式,使人们对多糖作用途径有更加深入的了解,为多糖剂型的改变以及改造多糖的分子结构使之更有效的调节人体的免疫功能奠定基础。本研究选用黄芪多糖、猪苓多糖为研究对象,体外建立SW480单层肠上皮模型,用LPS模拟肠道内环境,探讨黄芪多糖、猪苓多糖对SW480细胞HBD-1(humanβ-defensins-1)、HBD-2(humanβ-defensins-2)mRNA、IL-8以及TLR4表达的情况,并进一步研究了黄芪多糖、猪苓多糖刺激肠上皮产生的细胞因子对巨噬化细胞THP-1吞噬功能产生的影响。1.实验研究1.1 SW480细胞生物特性的研究绘制SW480生长曲线,筛选最佳接种数;用CCK-8法检测SW480细胞对脂多糖敏感性,根据实验结果、参考资料选择合适的刺激浓度以模拟肠道下段的肠内环境;黄芪多糖和猪苓多糖对SW480毒性实验,选择适宜的黄芪多糖(APS)和猪苓多糖(PUPS)的作用浓度。1.2黄芪多糖、猪苓多糖对SW480细胞HBD-1、HBD-2 mRNA表达的影响用RT-PCR技术检测APS、PUPS对单层肠上皮细胞SW480两种模型HBD-1、HBD-2 mRNA表达的影响。1.3黄芪多糖、猪苓多糖对SW480细胞IL-8表达的影响分别用RT-PCR、ELISA技术检测APS、PUPS对单层肠上皮细胞SW480两种模型IL-8 mRNA表达及其分泌。1.4黄芪多糖、猪苓多糖对SW480细胞TLR4表达的影响分别应用RT-PCR、FCM检测APS、PUPS作用于单层肠上皮细胞SW480两种模型后TLR4mRNA、细胞表面TLR4表达情况,探讨黄芪、猪苓多糖在肠上皮细胞SW480的可能性受体。1.5黄芪多糖、猪苓多糖对肠上皮细胞与固有层MΦ“对话”的影响黄芪多糖、猪苓多糖作用于单层肠上皮细胞SW480两种模型,其条件培养液与巨噬细胞化THP-1共培养,利用巨噬细胞吞噬惰性物质的原理,吞噬荧光标记的乳胶微球,用流式细胞术检测了吞噬荧光微球的THP-1巨噬细胞,计算其吞噬率和吞噬指数。2.结论2.1 APS、PUPS可能通过TLR4受体诱导SW480细胞表达HBD-2、IL-8在正常机体,小肠近端处于无菌状态,小肠远端与结肠存在大量细菌和高浓度LPS,本实验体外培养SW-480细胞并建立SW480细胞未刺激及LPS刺激SW480细胞两种模型模拟肠道上段、下段细胞生理状态,探讨APS、PUPS对SW480细胞β-防御素HBD-1、HBD-2及IL-8表达的影响,并进一步探讨其作用的可能性受体。首先应用RT-PCR检测APS、PUPS对肠上皮细胞SW480 HBD-1、HBD-2 mRNA表达的影响,结果表明APS、PUPS不影响肠道HBD-1 mRNA的表达,但可诱导肠道上段的上皮细胞表达HBD-2 mRNA,对肠道下段HBD-2 mRNA的表达没有影响;肠上皮细胞是机体细胞因子IL-8的主要来源,进一步应用RT-PCR、ELISA检测APS、PUPS作用后SW480细胞IL-8的表达,结果表明APS或PUPS诱导IL-8 RNA转录进而促进其分泌;既往研究表明激活TLR4信号通路可促进HBD-2、IL-8的转录与翻译,故应用RT-PCR、FCM对SW480细胞TLR4受体表达情况进行了检测,结果提示TL R4可能是SW480识别APS、PUPS的受体。2.2 APS、PUPS经肠上皮细胞提高巨噬细胞的吞噬功能IEC与固有层MΦ毗邻,两者间存在一定程度的对话,IEC通过旁分泌途径影响肠道MΦ的吞噬功能。本实验通过建立SW480细胞未刺激及LPS刺激SW480细胞两种模型模拟肠道上段、下段细胞生理状态,采用PMA诱导的巨噬化细胞THP-1模拟肠道MΦ,探讨APS、PUPS经IEC对MΦ吞噬功能的影响,结果表明APS、PUPS诱导IEC产生细胞因子可提高MΦ的吞噬率,且在肠道下段APS、PUPS经IEC可提高MΦ吞噬指数。总之,APS、PUPS可以通过对IEC的作用提高MΦ的吞噬功能。3.研究意义本实验通过建立SW480细胞未刺激及LPS刺激SW480细胞两种模型模拟肠道上段、下段肠上皮细胞生理状态,来探讨黄芪多糖与猪苓多糖对肠上皮细胞β-防御素HBD-1与HBD-2、趋化因子IL-8的表达及其经肠上皮细胞对固有层MΦ吞噬功能的影响,并进一步检测了黄芪多糖、猪苓多糖在肠上皮细胞SW480的可能受体TLR4。明确了口服APS、PUPS可以通过与肠上皮细胞作用,发挥其免疫调节的作用方式,为全面研究多糖在肠道的作用机制、寻找多糖作用的新靶点奠定了基础。