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家蚕因其强大的泌丝吐丝能力而蜚声古今中外,在长达数千年的饲养和驯化中为世界经济和文化交流做出了重要的贡献。蚕丝纤维是复杂的蛋白质微细纤维的集合体,具有优良的光泽、色调、手感而且在吸湿性、吸气性、对皮肤的亲和性等许多方面具有出色的性能。然而蚕丝也有不耐磨、易黄化褪色等缺点,且强度也不如蜘蛛丝等纤维。因此如何改造蚕丝,使蚕丝获得高茧丝强度、强延伸性、易染色、高肌肤亲和性等优质性能一直是一个研究难题。由于家蚕是经过数千年选育出来的,普通的遗传育种方法已很难改变其蚕丝特性,而蚕丝丝素重链的的高表达量、高度重复序列和高分子量使得用常规的转基因技术也难以对其进行研究和改造。近些年发展起来的锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)技术由于其能特异性的识别靶向基因的DNA序列,并造成DNA的双链断裂(DSB)进而刺激机体自身的修复途径,通过同源重组(Homologous recombina-tion, HR)和非同源性末端链接(Non-homologous end joining, NHEJ)两种方式实现靶向基因的敲除和敲入。目前,这一技术已被广泛的应用于动植物的基因敲除和定点改造之中。本研究以丝素重链基因为靶标,利用新近发展起来的锌指核酸酶技术,以多化性家蚕品种“N4”和滞育性家蚕品种“大造”为显微注射材料,高效的对家蚕丝素重链基因进行了敲除,首次获得了包括在丝素重链基因N端非重复区域部分缺失、部分碱基突变或小片段插入的一系列突变家蚕品系。并完成了突变位点的测序分析、丝腺的表型观察及突变蚕茧与野生型家蚕蚕茧的比较分析;在丝素重链突变品系中高量表达了绿色荧光蛋白,不但为家蚕丝蛋白基因的遗传改良提供了一种全新的思路和方法,也为利用家蚕丝腺作为生物反应器表达外源蛋白提供了有价值的参考。获得的主要结果如下：1.根据对家蚕丝素重链基因的序列特征进行分析,及其在不同蚕品系中SNP分布情况,以及结合锌指蛋白识别DNA序列的特性,我们选择CTGTTGCTCAAA GTTATGTTGCTGCTGATGCGGGAGCA作为锌指核酸酶识别的靶位点,该靶位点位于家蚕丝素重链基因的N端非重复区域,并据此设计和合成针对丝素重链基因的靶向敲除的锌指核酸酶载体。2.我们将合成的FibH-ZFN的mRNA注射了多化性家蚕品种“N4”和滞育性家蚕品种“大造”两个品种,分别在G1代的29和38个蛾圈中发现250和105头突变体,其表型出现裸蛹或者茧层稀薄的“丝胶茧”。3.从筛选的突变体中选取117个表现型均为裸蛹或“丝胶茧”的突变个体进行测序分析,测序结果表明所选取的117个突变个体在锌指核酸酶靶位点均发生了突变,具体序列如SEQ ID NO:2-118,这些突变包括变异、缺失和小片段的插入。4.解剖突变品系的家蚕和野生型家蚕,观察他们丝腺,发现突变品系的丝腺明显小于正常家蚕的丝腺,其后部丝腺也出现退化现象；比较它们的茧丝的细薄、茧层的厚度及茧丝的重量,突变品系都要小于野生型家蚕的茧丝；通过蛋白电泳对茧丝成分的分析,发现突变品系的茧丝不含丝素蛋白,只有丝胶蛋白。5.构建融合了家蚕丝素重链基因的非重复区域的GFP转基因载体,将其插入到丝素重链突变品系中去,通过蛋白水平的检测,发现其表达水平高于以野生型为材料的转基因家蚕,这也是我们的丝素重链突变品系作为家蚕丝腺生物反应器的可行性依据。