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猪链球菌(Streptococcus suis)能引起猪脑膜炎、关节炎、败血症甚至死亡,也可导致生猪从业人员的感染和死亡,是一种重要的人畜共患病病原体。根据荚膜多糖的抗原性差异,猪链球菌分33个血清型,其中2型(SS2)分布最广,分离率最高,致病性最强。此外,9型(SS9)也是一个重要的致病血清型,在澳大利亚、荷兰、比利时、德国等国家SS9流行较广。近年来,在中国的发病猪中也经常分离SS9,且呈上升趋势。目前,猪链球菌的毒力因子的研究大都集中于SS2, SS9的相关研究很少。本研究采用抑制性差减杂交技术筛选及鉴定SS9毒力相关基因,并对部分基因的特性进行了较为深入的探索。1抑制性差减杂交为了获得毒力株所特有的基因片段,将SS9强毒株GZ0565与无毒株SH040917进行抑制性差减杂交。提取两株细菌基因组DNA, RsaI酶切回收。酶切的GZ0565(tester)基因组分别连接两个不同的接头.经过两轮杂交后,PCR扩增tester特有基因序列。扩增产物连接T载体转化大肠杆菌TOP10。随机挑取304个转化克隆,PCR分析结果显示其中286个为阳性克隆。2可能毒力基因的筛选及功能预测286个为阳性克隆的PCR产物变性固定于尼龙膜,分别与地高辛标记的GZ0565及SH040917酶切基因组DNA杂交。获得了61个毒力株GZ0565特异的基因片段。生物信息学分析结果表明这些片段编码30种不同的蛋白,包括编码溶血素相关蛋白、DNA核酸酶、类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶、丝氨酸苏氨酸磷酸化酶等。3可能毒力基因片段的分布分析根据测序结果和同源性分析,选择14个具有代表性的差减片段设计引物,PCR检测这些片段在SS其他菌株上的分布。结果表明,这14个基因片段,在SS9菌株中,不同地区不同年份的临床分离株中均有广泛分布,无毒株SH040917全部阴性,屠宰分离株只有个别基因片段的分布；在SS2的致病菌株中有广泛分布。4猪链球菌9型丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶基因缺失株的构建及生物学特性分析丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶(serine/threonine phosphatase, STP)能够催化蛋白质的去磷酸化,与细胞内信号传递密切相关,且影响细菌的毒力和形态。为了进一步研究STP在SS9致病过程中的作用,本研究利用温度敏感型穿梭自杀质粒pSET4s定点敲除stp基因,获得基因缺失株△stp。将stp定向克隆至穿梭质粒pSET2中,构建互补质粒pSET2-STP,得到质粒介导的互补株C△stp.试验结果表明,缺失株△stp对HEp-2细胞的粘附能力明显下降,是野生株的粘附水平的68.8%,互补株C△stp的粘附能力比缺失株高,但是没有达到野生株的水平,是野生株的86.3%。缺失株△stp在全血中的存活能力明显减弱,野生株GZ0565的存活率是45.7%,缺失株△stp的存活率是23.4%,互补株C4stp的存活率是36.8%,比缺失株高,但是未达到野生株的水平。以CD1小鼠为模型比较了不同菌株的毒力,结果显示stp基因缺失后SS9毒力明显下降,缺失株△stp的LD50(1.93×107CFU)是野生株LD50(2.69×106CFU)的7倍,互补株C△stp的LDso为6.8×106CFU,是野生株的2.5倍。这些数据表明stp与SS9的致病性相关。5猪链球菌9型溶血素相关蛋白基因缺失株的构建及生物学特性分析溶血素(hemolysin)是细胞溶素家族的一个成员,能够使宿主细胞溶解的毒素,也是多种致病菌产生的重要致病因子。本研究前期鉴定出一个溶血素相关蛋白(Hemolysins and related proteins containing CBS domains, HlyC)基因,原核表达并纯化该蛋白,结果显示,rHlyC无溶血活性。为了进一步研究HlyC在SS9菌的致病过程中的作用,利用温度敏感型穿梭自杀质粒pSET4s定点敲除hlyC基因,获得基因缺失株△hlyC。将hlyC定向克隆至穿梭质粒pSET2中,构建互补质粒pSET2-HlyC,得到质粒介导的互补株pCHlyC。试验结果表明,hlyC缺失后,细菌溶解绵羊红细胞的能力无明显变化。突变株△hlyC对HEp-2细胞的粘附能力明显下降,是野生株的粘附水平的30.4%,互补株pCHlyC的粘附能力比缺失株高,但是未达到野生株的水平,是野生株的88%。突变株△hlyC在全血中的存活能力明显增强,野生株GZ0565的存活率是45.7%,突变株△hlyC的存活率是60.5%,互补株的存活率是48.2%。以CD1小鼠为模型比较了不同菌株的毒力,结果表明基因缺失后SS9毒力明显上升,野生株GZ0565的LD50(2.69×106CFU)比突变株△hlyC的LD50(3.79×105CFU)高7倍,对小鼠致病性增强,互补株LD50为1.49×106CFU。这些数据表明H1yC无溶血活性,与细菌的致病性密切相关。6猪链球菌2型内皮翻转酶的免疫学特性分析利用免疫蛋白组学方法,鉴定出猪链球菌2型江苏分离株HA9801具有免疫反应性的蛋白HM1。应用同源性比对、信号肽预测、跨膜区预测及亚定位预测等生物信息学方法对该蛋白进行分析,结果显示：同源性最高的蛋白为牙龈卟啉单胞菌的内肽酶(29%)；该蛋白序列中含有信号肽结构；无跨膜区,PCR检测该基因在SS2中的分布情况,并扩增出该蛋白的出信号肽以外的基因序列定向克隆到表达载体pET28a(+)中并转化大肠杆菌BL21(DE3).重组菌经IPTG诱导后的SDS-PAGE图谱在66kDa处出现融合蛋白的条带。Western blot表明,此重组蛋白rECE可被SPF微型猪抗SS2血清所识别,提示该蛋白可作为该菌的亚单位疫苗的候选物。纯化蛋白rECE能够黏附细胞外基质成分,间接免疫荧光试验证实该蛋白能够粘附上皮细胞,且该蛋白能抑制细菌对上皮细胞的粘附。rECE免疫小鼠后能够刺激机体产生特异性的抗体,能够提供70%的保护。